首次换液时间对贴壁法培养骨髓间充质干细胞纯度及增殖的影响

摘要

目的:观察不同时间首次换液对贴壁法培养骨髓间充质干细胞形态和表面标志物表达的影响。方法:实验于2005-09/2006-12在湖南中医药大学内科实验室完成。实验材料:三四周龄昆明种小鼠由湖南中医药大学实验动物室提供(许可证号:医动字第20-002号)。实验方法:无菌条件下分离小鼠股骨,以低糖DMEM培养液冲出骨髓,1000r/min离心10min,去除脂肪和上清液,DMEM重悬,洗涤细胞,同样条件下离心,弃上清液,将获得的骨髓间充质干细胞用含体积分数为0.15胎牛血清、105U/L青霉素G、100mg/L链霉素的低糖DMEM完全培养基重悬沉淀,以1×108L-1接种于24孔板,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养。第1组于24h全量换液,第2组于3d全量换液,第3组于5d全量换液。比较骨髓间充质干细胞在原代培养24h、3d、5d首次换液后细胞形态、生长曲线和表面标志物表达。结果:①骨髓间充质干细胞形态:原代培养24h换液,可见少量贴壁细胞,形态不规则。原代培养3d首次换液,可见较多贴壁细胞,并形成细胞团,细胞为椭圆形、短梭形。原代培养5d换液,可见明显集落形成,贴壁细胞量多,细胞呈梭形。②骨髓间充质干细胞生长曲线:原代培养24h首次换液,骨髓间充质干细胞生长较缓慢,对数生长期晚;原代培养3d首次换液,骨髓间充质干细胞增殖速度快,对数生长期早;原代培养5d首次换液,骨髓间充质干细胞前6d生长速度较快,6d后生长渐缓慢。③骨髓间充质干细胞表面抗原:三组间比较CD44、CD45阳性表达率差异均具有显著性意义[24h首次换液:(88.13±1.60)%,(26.25±2.60)%;3d首次换液:(85.21±1.80)%,(29.37±1.30)%;5d首次换液:(79.85±1.50)%,(36.54±1.20)%,P<0.01]。结论:不同时间首次换液对贴壁法骨髓间充质干细胞的生长有影响,单从细胞纯度来考虑,24h首次换液较为理想,从细胞生长情况和纯度综合考虑,3d首次换液较为理想。