12-烷基化壳聚糖纳米粒包裹反义内皮素转换酶核酸表达质粒在哮喘基因治疗中的特征

摘要

目的:气道给予12-烷基化壳聚糖纳米粒包裹的反义内皮素转换酶核酸表达质粒,观察对卵清蛋白致敏的小鼠变应性气道炎症的影响,并与裸DNA组小鼠作比较.方法:实验于 2004-03/2006-02在广州医学院第一附属医院海印分院15楼实验室完成.①40只Balb/c小鼠采用随机数字法分为4组,每组10只.②12-烷基化壳聚糖纳米粒的制备:将12-烷基化壳聚糖纳米絮状物溶于 0.05 mol/L醋酸钠/0.05 mol/L醋酸溶液中,浓度0.02wt%,将反义内皮素转换酶核酸溶于25 mmol/L的Na2SO4溶液中,浓度0.01wt%,按烷基化壳聚糖与反义内皮素转换酶核酸按不同质量比制备包裹反义内皮素转换酶核酸的12-烷基化壳聚糖纳米粒.③凝胶阻滞实验:为检测pH值对DNA结合力的影响,在pH=3,4,5,6,7,8时,反义内皮素转换酶核酸与12-烷基化壳聚特纳水粒按质量比为1∶2,4,8的比例混合;为检测不同质量比时12-烷基化壳聚糖纳米粒对DNA结合力的影响,在pH=6时,反义内皮素转换酶核酸与12-烷基化壳聚糖纳水粒按质量比为1∶0.5,1,2,4,8,16,32的比例混合;反义内皮素转换酶核酸的浓度恒定为1 g/100 L,10 g/L琼脂糖凝胶电泳60 V电泳1 h.④包裹反义内皮素转换酶核酸的12-烷基化壳聚糖纳米粒治疗组(纳米粒治疗组)、卵清蛋白致敏激发组、卵清蛋白致敏激发并给予裸DNA组(裸DNA组)于第0天与和14天每只小鼠分别腹腔注射卵清蛋白致敏液0.2 mL,生理盐水刘照组注射等体积的生理盐水;前3组于第24,25,26天,以10 g/L卵清蛋白溶液8 mL雾化吸入.生理盐水对照组用等体积生理盐水雾化作为对照.纳米粒治疗组、卵清蛋白致敏激发组和裸DNA组于激发前24 h分别给予气道灌注包裹反义内皮素转换酶核酸的12-烷基化壳聚糖纳米粒75 μL、生理盐水75 μL和反义内皮素转换酶核酸5 μg加生理盐水(总量75 μL),生理盐水对照组灌注生理盐水75 μL.⑤末次激发后24 h进行支气管肺泡灌洗,计算支气管肺泡灌洗液中细胞总数、分类计数.肺组织病理切片,苏木精-伊红染色;观察各组小鼠肺组织的病理变化.ELISA法检测肺组织匀浆上清白细胞介素4、白细胞介素5、干扰素-γ和内皮素1水平.结果:小鼠40只小鼠全部进入结果分析.①凝胶阻滞实验结果:12-烷基化壳聚糖纳米粒在pH7以下均能很好地与反义内皮素转换酶核酸结合,但是在pH为8时,显示结合不完全;在12-烷基化壳聚糖纳米粒与反义内皮素转换酶核酸质量比为1∶1时,全部反义内皮素转换酶核酸被结合.②各组小鼠支气管肺泡灌洗液细胞学检查结果:与生理盐水对照组小鼠相比,卵清蛋白致敏激发组、裸DNA组和纳米粒治疗组细胞总数、Eos百分比与Eos绝对计数均升高(P＜0.01).纳米粒治疗组上述3种指标均显著低于卵清蛋白致敏激发组和裸DNA组小鼠(P＜0.01或P＜0.05).③各组小鼠肺组织病理改变:纳米粒治疗组肺部炎症改变较卵清蛋白致敏激发组和裸DNA组有所减轻,但较生理盐水对照组还是有所加重.④各组小鼠肺匀浆上清细胞因子检测结果:生理盐水对照组内皮素1、白细胞介素4,5水平均明显低于纳米粒治疗组、卵清蛋白致敏激发组和裸DNA组(P＜0.05或P＜0.01),而纳米粒治疗组以上各细胞因子水平则明显低于卵清蛋白致敏激发组和裸DNA组[白细胞介素4各组依次为:(70.7±17.9),(107.7±20.6),(108.66±19.0)ng/L,白细胞介素5各组依次为:(55.4±7.0),(64.3±8.5),(66.4±6.9)ng/L,内皮素各组依次为:(18.5±1.4),(28.9±2.3),(27.1±1.6)ng/L,P＜0.05或P＜0.01].结论:①12-烷基化壳聚糖纳米粒包裹的反义内皮素转换酶核酸能够成功在小鼠气道表达,通过RNAi干扰内皮素转换酶生成,阻滞大内皮素转换为活性内皮素,减少内皮素的合成,减轻变应性气道炎症.②而卵清蛋白致敏激发并给予裸DNA组与卵清蛋白致敏激发组比较差异无显著性,表明裸DNA难以通过气道内注入在活体动物气道表达.