不同胎龄大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的比较(英文)

摘要

背景：胚胎来源干细胞的分化潜能不仅受到诱导条件影响，也受来源胚胎胚龄的影响。目的：实验拟观察不同胎龄大鼠中脑神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化能力。设计：随机对照观察。单位：中山大学附属第一医院神经外科。材料：实验于2007—03／2007—09在中山大学附属第一医院实验室完成。成年孕SD大鼠30只，体质量350～400g，由中山大学动物实验中心提供。许可证号码为SCXK（粤）2007—0034。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。DMEM／F12无血清培养液、B27添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、体积分数为0．1的胎牛血清为英国Gibco公司产品；白细胞介素1α，白细胞介素11、胶质细胞源性神经营养因子购自美国R＆D公司；白血病抑制因子购自英国PEPROTECH公司；酪氨酸羟化酶抗体购自美国Santa Cruz公司；巢蛋白抗体、微管相关蛋白2抗体及胶质纤维酸性蛋白抗体为美国CHEMICON公司产品。方法：①分别于大鼠孕10，12，14，16，18天摸球法随机选取6只，麻醉后处死孕鼠，无菌条件下剖腹取胚胎，分离中脑腹侧脑组织进行神经干细胞培养。在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中分别培养不同胎龄大鼠脑神经干细胞，经传代扩增后，在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化。②诱导分化6d后观察分化细胞生长情况并进行免疫细胞化学鉴定；酪氨酸羟化酶染色标记后通过流式细胞仪检测分化的多巴胺能神经元比率。主要观察指标：①不同胎龄大鼠神经干细胞诱导分化后生长情况及免疫细胞化学鉴定结果。②神经干细胞诱导分化后酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率。结果：①孕10，12，14，16，18d胚胎大鼠中脑神经干细胞球在诱导分化液中贴壁生长，球内细胞从球体中央逐渐向外呈放射状生长，分化6天的细胞多数有1～2个长突起或有多个短突起。神经球经巢蛋白免疫细胞化学染色，大部分细胞胞浆染色呈阳性。②孕10，12，14，16，18d胚胎大鼠中脑神经干细胞在诱导分化液中培养6d后，流式细胞仪检测其诱导分化成酪氨酸羟化酶阳性细胞的比率分别为（10．3±2．5）％，（21.6±3.4）％．（16．7±2．8）％，（14．2±3.2）％，（8．9±1．8）％，各组间比较差异均有显著性意义（P〈0．05），其中孕12d大鼠中脑神经干细胞诱导分化成多巴胺能神经元比例最高。结论：不同胎龄大鼠中脑的神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的能力不同，以孕12d诱导分化成多巴胺能神经元比例最高。