人胚胎原始生殖细胞移植治疗大鼠急性肝损伤

摘要

目的：胚胎原始生殖细胞能以原始胚胎状态无限增殖,并可通过异体移植或适宜的体外环境自然分化为胚胎生殖层。实验拟进一步观察体外培养的胚胎原始生殖细胞对急性肝损伤大鼠的治疗效果,及其能否在大鼠体内分化为肝细胞。方法：实验于2003-09/2005-05在中南大学肝病研究所完成。①细胞及动物：经中南大学湘雅二医院医学伦理委员会批准,取孕4～12周流产人胚胎,其双亲3代内无遗传性疾病,孕妇对流产胚胎用于实验均签署知情同意书。清洁级健康成年SD大鼠50只,随机数字表法分为5组：培养基对照组、单纯人胚原始生殖细胞组、人胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组、单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组,10只/组。另选取健康成年SD孕鼠4只用于分离鼠胚原始生殖细胞。动物均由中南大学湘雅二医院动物实验中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：从人胚胎中分离出原始生殖嵴组织,悬浮培养获取人胚原始生殖细胞,用含15%胎牛血清的高糖DMEM基础培养基调节细胞浓度至1×10^8L^-1。取SD孕鼠胚胎分离生殖嵴,消化离心培养鼠胚原始生殖细胞,浓度1×10^8L^-1。各组大鼠均于腹腔内注射D-氨基半乳糖建立急性肝损伤模型,造模后48h,培养基对照组自尾静脉输注基础培养基,其余4组给予对应细胞悬液及免疫抑制剂环磷酰胺。③实验评估：从细胞形态、表面标记及体外分化等方面检测人胚原始生殖细胞的生物学特性;比较各组大鼠肝功能、增殖细胞核抗原阳性率、糖原染色阳性率、肝脏病理改变;检测各组大鼠肝脏病理切片中人白蛋白、甲胎蛋白的表达。结果：①人胚原始生殖细胞的生物学特性：培养1d后单个原始生殖细胞形成细胞集落,以后集落逐渐增大并隆起,形成鸟巢状,周边界限清晰,内部细胞排列紧密。传代后原始生殖细胞集落呈自发分化趋势,周边出现成纤维样细胞,最后分化为梭形细胞、多边形细胞等。原代至第3代未分化的人胚原始生殖细胞集落碱性磷酸酶染色均呈阳性,分化的细胞及成纤维细胞呈阴性。②肝功能检测：细胞输注前各组丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素水平均基本相似（t=0.361～1.183,P均〉0.05）。输注后7d与培养基对照组比较,单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组上述3项指标水平均明显降低（t=2.532～8.361,P均〈0.05）;后两组间比较差异无显著性意义（t=0.340～1.712,P均〉0.05）。③增殖细胞核抗原阳性率：细胞输注后7d与培养基对照组比较,单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组的增殖细胞核抗原阳性率均明显升高（t=9.020～10.747,P均〈0.001）;后两组间比较差异无显著性意义（t=0.752,P=0.462）。④糖原染色：细胞输注后7d,培养基对照组着色相对浅淡,呈细颗粒状,;单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组着色相对深粗,呈斑块状聚集。⑤病理检测：细胞输注后7d,培养基对照组肝索、肝窦结构排列欠规则,坏死区可见少量肝细胞再生,汇管区有大量炎症细胞浸润;单纯鼠胚原始生殖细胞组、鼠胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组各项病理情况均显著改善。⑥大鼠肝组织人白蛋白、甲胎蛋白的表达：细胞输注后14,21d,单纯人胚原始生殖细胞组、人胚原始生殖细胞＋环磷酰胺组表达人白蛋白及甲胎蛋白阳性细胞,培养基对照组未见表达。结论：①胚胎原始生殖细胞移植有利于激发急性肝损伤大鼠肝细胞的增殖,改善肝功能,加速受损肝细胞的病理修复。②胚胎原始生殖细胞可在受体肝脏组织中生存,并分化为具有合成白蛋白及甲胎蛋白功能的肝细胞样细胞。