新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法

摘要

背景:新生大鼠肝细胞是中度分化细胞,兼具肝祖细胞和成熟肝细胞的特性和功能,是研究肝细胞特性的理想细胞来源。目的:探讨新生大鼠肝细胞分离及体外培养方法。设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/08在解放军总医院普通外科研究所完成。材料:SD新生大鼠,雌雄不限,3月龄。方法:采用组织块-胰酶冷消化法和多步低速离心获取新生大鼠肝细胞,给予含体积分数10%胎牛血清的HepatoZYME-SFM培养基体外二维培养。采用相差显微镜观察、MTT分析、PAS染色和脲酶法对培养的肝细胞生长及功能进行检测和分析。主要观察指标:肝细胞形态、活性,糖原水平,培养上清中的尿素浓度。结果:分离纯化的新生大鼠肝细胞总数1.0×106～2×106/肝,活力在90%以上,光镜下肝细胞呈圆形或卵圆形,核大而圆,胞体较成熟肝细胞小。通过多步低速离心可去除红细胞、其他非实质细胞和死亡的肝细胞,其纯度可达95%以上。肝细胞活性在培养初期即缓慢上升,至第3天时开始快速增殖,第11天时达到高峰,与第1天相比差异有显著性意义(P=0),但随后又缓慢降低,到15天时与第11天相比差异有显著性意义(P=0)培养的肝细胞贴壁生长,并保持肝细胞特异细胞形态。培养至第7天的肝细胞PAS染色呈强阳性,之后阳性细胞逐渐减少,至15d时可见少量阳性细胞。培养上清中尿素在培养初期基本没有变化,培养至第7天时显著下降。结论:组织块-胰酶冷消化法和HepatoZYME-SFM培养基二维培养为种简单有效的新生大鼠肝细胞分离培养方法。