MAGE-3-HSP70融合基因真核表达载体的构建与鉴定

摘要

背景:疫苗诱导的抗肿瘤CD8+T细胞反应被认为在增加机体对肿瘤抵抗力方面起重要作用。研究发现,抗原递呈细胞摄取热休克蛋白70与肿瘤相关抗原的融合蛋白,并在MHCI类分子上处理提呈有此热休克蛋白为伴侣的肽后,会启动CD8+细胞毒性T淋巴细胞反应。目的:构建黑色素瘤抗原3(MAGE-3)、人热休克蛋白70(HSP70)融合基因的真核表达载体。设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-06/12在国家卫生部纳米生物技术重点实验室完成。材料:pcDNA3.1(-)Vector为BD公司产品,pINCY/MAGE-3,pOTB7/HSP70为OpenBiosystems公司产品,DH5α由纳米生物技术重点实验室保存。方法:设计含XhoⅠ酶切位点MAGE-3引物及含KpnⅠ酶切位点人热休克蛋白70引物,以pINCY/MAGE-3和pOTB7/HSP70为模板扩增黑色素瘤抗原3和人热休克蛋白70基因片段,以基因片段为模板,采用MAGE-3上游引物(含XhoⅠ酶切位点)及人热休克蛋白70下游引物(含KpnⅠ酶切位点),PCR扩增MAGE-3-HSP70融合基因片段,KpnⅠ和XhoⅠ双酶切并连接至pcDNA3.1(-),转化感受态大肠杆菌DH5α,获得阳性克隆进行双酶切和测序鉴定。主要观察指标:真核表达载体pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70的鉴定。结果:测序结果显示黑色素瘤抗原3与GeneBank上公布的序列完全一致,人热休克蛋白70有3处同义突变。结论:成功构建MAGE-3-HSP70融合基因真核表达载体。