大鼠半乳凝素9基因克隆及真核表达载体的构建

摘要

背景:研究提示,半乳凝素9在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控方面发挥作用,但其作用机制尚不明确。目的:克隆大鼠半乳凝素9基因片段,构建pDC316-GFP-Galectin-9真核表达质粒,以进一步了解半乳凝素9各种功能和反应机制,设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-11/2009-01在北京本元正阳基因技术有限公司完成。材料:SPF级雄性Lewis大鼠1只。方法:采用反转录聚合酶链反应技术,从大鼠肝脏组织中扩增出大鼠半乳凝素9基因片段,通过基因重组技术将该基因片段重组到pDC316-GFP真核表达载体上,构建pDC316-GFP-Galectin-9重组质粒,通过用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。主要观察指标:重组质粒的鉴定结果。结果:总RNA经RT-PCR扩增后,经琼脂糖凝胶电泳,在1kb下方可见一条明显扩增的条带,与预计的半乳凝素9-cDNA长度相符。重组质粒经NotⅠ/HindⅢ双酶切和未作酶切的重组质粒pDC316-GFP-Galectin-9一起经琼脂糖凝胶电泳,前者出现了980bp和5.8kb2条带(980bp为Galectin-9-cDNA产物,5.8kb为pDC316-GFP线状质粒),后者出现6.7kb条带(重组质粒pDC316-GFP-Galectin-9),初步表明重组质粒构建成功。测序结果用NCBI上的BLAST进行比对分析,其核酸序列与GeneBank中的半乳凝素9的mRNA的编码序列(NM_012977)同源性完全相符,进一步证实所克隆的基因为大鼠半乳凝素9-cDNA。结论:成功克隆了半乳凝素9基因并构建成其真核表达质粒。