应用间期荧光原位杂交技术探讨cyclin D1 基因在乳腺癌中的扩增

摘要

@@本研究将用间期荧光原位杂交(interphase fluorescence in situ hybridization，FISH)技术研究cyclin D1基因在乳腺癌中的变化，为乳腺癌的术后治疗与预后评估提供新的生物学信息。rn 1．材料与方法：（1）试验材料:选取40例经手术切除治疗而病理诊断为乳腺癌的肿瘤组织，按国际TNM分期法(UICC 1988年)临床上属Ⅰ、Ⅱ期患者20例,Ⅲ、Ⅳ期患者20例。（2）细胞悬液的制备:制备单个细胞悬液，在杂交前2～4 d，将单细胞悬液滴在经处理过的玻片上，自然风干备用。(3)探针的制备：Cyclin D1探针购自Vysis公司(Fluoro-phore直接标记，呈红色)。(4)间期荧光原位杂交检测方法:玻片用100 μl RNA酶(100 μg/ml)37 ℃消化1 h，于70%甲酰胺2×SSC中(73±1)℃变性5 min后脱水，风干；同时将探针混合液(Lysis 杂交Buffer 7 μl，探针1 μl，2 μl纯净水)置(73±1)℃水浴箱内变性5 min，然后将变性探针混合液加于变性的细胞玻片上，封闭，置37 ℃温箱杂交过夜。将盖玻片取下，放入45 ℃ 50% 2×SSC甲酰胺内10 min共3次，然后再放入2×SSC液中洗10 min，最后在室温放入加入0.1% NP-40的2×SSC内洗5 min和1 min（室温）凉干，加4′,6-二联脒-2-吲哚苯(DAPI)补染，在荧光显微镜下观看结果。（5）观察结果分析标准：在荧光显微镜下，选取肿瘤细胞分析，观察细胞核内荧光杂交信号并计数。每例计数100～200个细胞核。信号4～10为轻度扩增，10以上为