CCL20基因敲低型组织工程皮肤种子细胞的克隆筛选及其干扰效果

摘要

目的采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染人永生化角质形成细胞系（HaCaT）,筛选出稳定干扰CCL20基因表达的细胞克隆并检测其干扰效果。方法用CaCl2法将已构建好的3种pHSER-CCL20-shRNA-GFP载体（pHCG-1和pHCG-2为CCL20基因特异性,pHCG-3为CCL20基因错配）转染293FT包装出慢病毒颗粒,流式细胞术测定其病毒滴度。用G418压力筛选慢病毒感染的HaCaT,荧光定量RT-PCR和ELISA法分别检测CCL20基因mRNA和蛋白的表达水平,以判断其特异性干扰效果。结果三种慢病毒载体所包装出的慢病毒滴度分别为7.08×10~5转导单位（TU）/ml、1.88×10~5 TU/ml和2.08×10~5 TU/ml;感染后的HaCaT经过G418筛选5～8周,获得4株CCL20基因特异性的细胞克隆（HaCaT-1、HaCaT-2、HaCaT-3和HaCaT-4）及2株CCL20基因错配对照的细胞克隆（HaCaT-5和HaCaT-6）。经荧光定量PCR和ELISA法检测显示,4株CCL20基因特异性细胞克隆均具有稳定干扰效果,不仅能显著地下调CCL20基因的mRNA表达（其抑制率分别为81.0%、89.0%、81.3%、77.2%）,而且明显地减少CCL20蛋白分泌（其抑制率分别为70.0%、86.1%、88.1%、90.7%）。结论采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染HaCaT可以筛选出具有长期稳定表达RNA干扰效应的CCL20基因敲低型人永生化角质形成细胞克隆,将可能为低免疫排斥反应异基因组织工程皮肤的构建提供种子细胞。