马MHC-I-B_(2)蛋白对马疱疹病毒1型胞内复制影响的研究

摘要

为探明马MHC-I-B_(2)蛋白对马疱疹病毒1型(EHV-1)胞内复制的影响,本研究合成马MHC-I-B_(2)基因,并将其克隆至慢病毒表达载体,构建重组质粒pLVML-HA-MHC-IRES-Puro。利用慢病毒载体系统将pSPAX2、pMAD.2G、pLVML-HA-MHC-IRES-Puro共转染HEK-293T细胞,同时共转染pLenti-GFP-N2,pSPAX2和pMAD.2G质粒作为对照组,待对照组细胞出现绿色荧光时收获各组感染后的BHK-21细胞获得相应慢病毒。将上述慢病毒感染BHK-21细胞并经嘌呤霉素筛选后将获得表达马MHC-I-B_(2)的细胞并传20代,分别取第5、10、15、20代细胞,通过PCR检测马MHC-I-B_(2)的重链基因序列,分析构建细胞系的遗传稳定性,并利用western blot检测第20代细胞中马MHC-I-B_(2)重链基因的表达。结果显示,正确构建了稳定过表达马MHC-I-B_(2)蛋白的BHK-21细胞系(BHK-21-Equus MHC-I-B_(2))。采用EHV-1(MOI 0.1)感染BHK-21-Equus MHC-I-B2与其亲本细胞BHK-21,检测病毒滴度,结果显示BHK-21-Equus MHC-I-B_(2)细胞病变效应(CPE)更明显,病毒滴度比其亲本细胞提高了3.2~4.4倍,可见马MHC-I-B_(2)蛋白可显著提高EHV-1的增殖水平。本研究建立了稳定过表达马MHC-I-B_(2)蛋白的BHK-21细胞系,并首次证实马MHC-I-B_(2)蛋白对EHV-1的增殖具有促进作用,为今后EHV-1的感染机制研究奠定物质基础。