猪流行性腹泻病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用

摘要

为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究以PEDV N基因的保守序列为靶基因设计引物,优化并建立了基于RT-LAMP的PEDV快速检测方法.结果显示,RT-LAMP方法的最佳反应条件为:反应温度为61°C,反应时间为50min,Mg2+和dNTPs浓度分别为8.0mmol/L和4.0mmol/L,外引物和内引物最佳浓度比为1∶4.特异性试验结果显示,该方法只能检测出PEDV,对其他病原检测均为阴性,具有良好的特异性;敏感性试验结果显示,该方法能够检测出的最低RNA浓度为6.52×10-5 mg/L,而常规RT-PCR能检测到最低浓度为6.52×10-3 mg/L,表明RT-LAMP敏感性是RT-PCR的100倍;重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验结果无明显差异,重复性较好.利用RT-LAMP和RT-PCR方法分别对3份已知阳性样品,5份已知阴性样品以及52份未知临床样品进行检测.阳性样品经RT-LAMP和RT-PCR方法均检测到PEDV,阴性样品均未检测到PEDV.52份临床样品中,RT-LAMP对PEDV检测阳性率为23.08％(12/52);RT-PCR检测阳性率为17.31％(9/52),二者的符合率为94.23％.以上结果表明,建立的RT-LAMP方法具有成本低、检测快、灵敏度高、特异性强等优点.且结果易于判定、便于现场检测,在病原检测方面具有良好的应用前景,为该病的流行病学调查及综合防制提供重要的实验依据.