一株内毒素缺陷型大肠杆菌的构建与鉴定

摘要

为了降低大肠杆菌表达外源蛋白时产生的内毒素(LPS),本研究利用Red重组和Cre-Lox敲除系统相结合的方法,敲除大肠杆菌DH10B-2B中与LPS合成相关的基因kdsD、lpxL、lpxM、pagP、lpxP、eptA,并在其OmpT基因处插入弗朗西斯菌的磷酸酶基因lpxE去除LPS中类脂A的1-磷酸基团,获得改造的E.coli DH10B-2B-△6-lpxE.利用鲎试剂检测108 cfu/mL～105 cfu/mL DH10B-2B与DH 10B-2B-△6-lpxE经超声破碎的裂解液中LPS含量;将9组小鼠每组5只分别腹腔注射PBS及浓度为1010 cfu/mL～107 cfu/mL的两种裂解液,观察小鼠的临床症状并利用ELISA试剂盒检测小鼠脾脏中IL-6及TNF-a的表达水平.结果 显示,经鲎试剂检测106 cfu/mL DH10B-2B裂解液中的LPS结果为阳性,LPS含量≥10 000 U/mL,而108 cfu/mL DH10B-2B-△6-lpxE裂解液LPS结果虽为阳性,但LPS含量≤100 U/mL.将DH 10B-2B-△6-lpxE裂解液以109 cfu/mL的剂量腹腔注射的小鼠与对照组小鼠均无任何异常,而注射109 cfu/mL DH10B-2B裂解液的小鼠出现精神不振,反应迟钝,眼角有脓性分泌物以及腹泻等症状;IL-6及TNF-a检测结果显示,与DH10B-2B组小鼠相比,DH 10B-2B-△6-lpxE组小鼠细胞因子的表达水平明显降低.本研究通过对E.coli LPS合成过程中关键基因的改造获得一株LPS缺陷的大肠杆菌DH 10B-2B-△6-lpxE,其产生LPS的能力明显下降.该菌株既可以用作低LPS重组蛋白表达系统,也可以用于低毒力LPS的提取,为相关免疫增强剂的研究奠定基础.