牛病毒性腹泻病毒内标双重TaqMan荧光RT-PCR方法的建立及初步应用

摘要

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)内标双重TaqMan荧光RT-PCR方法,本研究根据BVDV 5'-UTR区序列设计引物和荧光标记探针,通过重叠延伸PCR (SOE-PCR)扩增获得内标模板,经体外转录得到可以作为内标物的cRNA.经反应条件的优化,建立了BVDV内标双重TaqMan荧光RT-PCR检测体系.结果表明:当cRNA浓度为103拷贝/μL时,二者均有较好的扩增曲线;该方法对Ⅰ型BVDV的检测灵敏度为0.25 TCID50,对Ⅱ型BVDV的检测灵敏度为2.5 TCID50;利用该方法对猪瘟病毒等其他相关核酸的检测结果均为阴性;重复性检测Ct值变异系数为0.54～4.73.对506份临床样品检测,结果有23份样品为阳性,阳性样品检出数量和编号与不含内标的单一荧光RT-PCR方法完全一致,表明该方法可以用来对BVDV进行准确、快速检测,并且可以对检测结果进行质量监控.