RIP3对A型塞内卡病毒复制影响的机制研究

摘要

为探究细胞程序性坏死的关键蛋白受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3)对A型塞内卡病毒(SVA)复制的影响及其潜在的作用机制,本研究采用SVA(MOI 1)感染PK-15细胞(PK-15+SVA),PK-15细胞作为对照组(Mock),采用western blot检测RIP3、磷酸化的RIP3(P-RIP3)、混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)与磷酸化MLKL(P-MLKL)蛋白表达。结果显示,SVA感染促进PK-15细胞中P-RIP3和P-MLKL蛋白表达量显著增多(P<0.05),表明SVA可激活程序性坏死相关蛋白RIP3和MLKL。利用RIP3特异性抑制剂GSK843处理PK-15细胞(PK-15+SVA+GSK843),在SVA(MOI 1)感染12 h、24 h和48 h后,利用western blot和qPCR检测SVA非结构蛋白3D的表达水平和SVA mRNA(24 h)的转录水平。结果显示,与Mock组相比,感染细胞中SVA 3D蛋白和SVA mRNA转录水平均显著增加(P<0.05)。利用western blot检测细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达;采用SVA感染敲低自噬蛋白5(ATG5)的PK-15细胞(ATG5 KD),利用western blot检测其中SVA 3D蛋白的表达;利用qPCR检测各组细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-βmRNA转录水平。结果显示,与Mock组相比,PK-15+SVA细胞中LC3-I的变化不明显,LC3-II蛋白表达水平明显下调;与PK-15+SVA组相比,PK-15+SVA+GSK843细胞中LC3-I变化不明显,LC3-II蛋白表达水平则明显增加。与SVA感染的PK-15细胞相比,SVA感染ATG5 KD中3D蛋白表达水平明显下降。qPCR结果显示,与未感染SVA的对照组相比,PK-15+SVA中4种细胞因子mRNA转录水平均显著或极显著上调(P<0.05、P<0.001、P<0.0001),与PK-15+SVA组相比,PK-15+SVA+GSK843细胞中4种细胞因子mRNA转录水平均显著或极显著下调(P<0.05、P<0.001、P<0.0001)。本研究上述结果首次表明RIP3可调控细胞自噬,影响SVA的复制,并参与调控细胞自噬的发生与炎性细胞因子的转录,该结果为进一步阐明SVA的致病机制及其感染的防治提供重要的科学依据。