人真皮微血管内皮细胞缺氧后处理模型的建立

摘要

目的探讨建立人真皮微血管内皮细胞的缺氧后处理模型的方法。方法采用酶消化加磁珠分选的方法,获得人真皮微血管内皮细胞,用5%ECM培养基培养,取第6~8代细胞备用,在进行缺氧处理后复氧前,将细胞进行3次一定时间的缺氧/复氧交替处理;将细胞接种于6孔板,1个6孔板为1组,共6组。1组:不作任何处理;2组:缺氧8 h+复氧24 h;3组:缺氧8 h+2 min×3次缺氧后处理;4组:缺氧8 h+5 min×3次缺氧后处理;5组:缺氧8 h+10 min×3次缺氧后处理;6组:缺氧8 h+20 min×3次缺氧后处理。各组经过8 h缺氧箱+缺氧Buffer的缺氧处理和24 h复氧后,检测乳酸脱氢酶（LDH）随缺氧时间含量的变化;Tunel法染色计算各组的细胞凋亡率;用Western Blot的方法检测Bcl-2、Bax和caspase-3以及活化caspase-3的蛋白含量表达。实验数据采用SPSS 18.0进行统计分析,2组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析。结果在连续的缺氧过程中,LDH含量在8 h（1563±83.35）IU/L与0 h（582.85±58.25）IU/L比较,差异有统计学意义（P=0.0001）。Western Blot结果:2组Bax/Bcl-2表达含量为0.38±0.02,2组与3组0.23±0.01和4组0.22±0.02比较,差异有统计学意义（P=0.012,P=0.005）,2组与5组0.33±0.02和6组0.34±0.01比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。2组活化的caspase-3/caspase-3比例为6.30±1.50,与3组2.17±0.26和4组2.63±0.31比较,差异有统计学意义（P=0.008,P=0.019）;2组与5组4.36±0.29和6组4.97±0.51比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论成功地建立了人真皮微血管内皮细胞缺氧后处理模型。