人真皮微血管内皮细胞的原代培养及低氧/复氧模型的建立

摘要

目的:培养人真皮微血管内皮细胞,建立人真皮微血管内皮细胞低氧/复氧模型.方法:采用酶消化及联合磁珠分选法,得到人真皮微血管内皮细胞(HDMECs),体外培养传至P5代,采用Ⅷ因子免疫荧光及CD309、CD34流式细胞学进行鉴定.用缺氧Buffer加低氧舱的方法低氧处理P5代HD-MECS.实验分为四组,Con组不做任何处理、H8组低氧8小时组,H8R12组低氧8小时复氧12小时组、H8R24组低氧8小时复氧24小时组.TUNEL(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法)染色法检测细胞凋亡,蛋白质印迹法(Western Blot)检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白的表达.结果:联合法分离的细胞,经过2次CD31磁珠分选后,可见细胞短梭形,呈铺路石样.细胞传至P5,Ⅷ因子免疫荧光染色阳性率为(95±2.61)％.流式细胞仪检测CD309阳性率为(95.4±1.34)％;CD34阳性率为(42.5±3.23)％.TUNEL染色、Western Blot结果显示:H8组的细胞凋亡率和活化的Caspase-3表达高于Con组(P＜0.05),H8R12组、H8R24组细胞凋亡率和活化的Caspase-3表达高于H8组(P＜0.05).结论:本研究采用磁珠分选的办法成功培养了HDMECs,并且建立了HDMECs低氧/复氧模型,为临床研究游离皮瓣缺血再灌注损伤机制提供实验基础.