肛门直肠畸形大鼠盆底肌胚胎发育过程中细胞凋亡的研究

摘要

目的研究肛门直肠畸形鼠盆底肌胚胎发育过程中的凋亡现象,探索凋亡在盆底肌异常发育中的可能致病作用。方法体重250～300g的Wistar大白鼠74只随机分组,雌雄午夜合笼后次晨雌鼠阴道涂片,显微镜下见到精子即确认已交配,此日计妊娠第0天。ETU组:52只大鼠于妊娠第10天经胃管注入125 mg/kg的乙烯硫脲。正常对照组:22只大鼠于妊娠第10天经胃管注入等量的生理盐水。妊娠第16、17、19、21天剖宫取胎,经连续石蜡切片及提取盆底横纹肌复合体,应用TUNEL染色及DNA Ladder方法检测盆底肌的凋亡,免疫组织化学及RT-PCR方法分析Bcl-2/Bax在盆底肌中的表达。结果①正常对照组共孕雄性胎鼠108只,未见畸形发生。ETU致畸组共得雄性胎鼠247只,肛门直肠畸形173只,其中伴发脊柱裂或脊膜膨出21只（12.1%:21/173）,3.5%（6/173）伴有肢体畸形（肢体缺如或马蹄内翻足）;②在正常组中,孕17 d后出现TUNEL阳性染色,散在分布于横纹肌复合体与球海绵体肌交界区及直肠后两侧横纹肌复合体汇合处;畸形组,孕16 d已有TUNEL阳性染色,大量的阳性染色细胞主要分布在横纹肌复合体的背侧;两组DNA电泳时出现均出现DNA梯度,以畸形组明显;③在两组中,孕17 d时开始出现Bax及Bcl-2的表达,孕19 d及孕21 d表达增强。与正常组相比,Bcl-2表达下调（分别为0.44±0.06比0.49±0.07,0.69±0.09比0.90±0.14,0.51±0.07比0.71±0.11）,孕19 d及21 d时差异有统计学意义。而Bax基因在畸形组中表达上调（分别为0.39±0.05比0.31±0.05,00.47±0.06比0.37±0.06,0.40±0.05比0.37±0.05）,孕17 d及19 d时差异有统计学意义。RT-PCR的结果提示畸形组Bax表达显著增强而Bcl～2表达减弱,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论肛门直肠畸形鼠盆底肌存在异常凋亡及Bax/Bcl～2表达紊乱,过早、过度及异位的凋亡可能是肛门直肠畸形时盆底肌发育异常机制之一;Bax/Bcl-2在盆底肌中的时空表达,提示其在盆底肌凋亡过程中的重要调节作用。