内皮微粒对血管内皮细胞衰老的影响及机制研究

摘要

目的:探讨内皮微粒(EMPs)对血管内皮细胞衰老的影响及作用机制.方法:通过体外传代,将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养至第10～12代,建立复制性衰老模型.实验分为年轻组(2～4代)、衰老组(10～12代)及EMPs干预组(提取衰老细胞产生的EMPs来干预年轻细胞).结合衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法和PI单染法检测细胞周期两种方法判断细胞衰老情况.采用两步离心法分离出EMPs;采用醋酸双氧铀负染法于透射电镜下观察EMPs的大小及形态;流式细胞术检测CD31+或Annexin V+的EMPs;DCFDA染色检测细胞内活性氧簇(ROS)的表达.结果:与年轻组相比,衰老组细胞SA-β-gal活性显著增强(P<0.01),细胞周期阻滞于S期(P<0.01),并且细胞内ROS水平显著升高(P<0.01);衰老组细胞分泌CD31+EMPs及Annexin V+EMPs的数量均显著高于年轻组(P<0.05).电镜下EMPs直径在0.1～1μm之间,形态呈圆形或椭圆形,其囊泡膜结构完整,边缘清楚,轮廓清晰.与年轻组相比,EMPs干预组细胞SA-β-gal活性增强(P<0.01),细胞周期阻滞于S期(P<0.01),细胞内ROS水平显著升高(P<0.01),并且增高的细胞内ROS可部分被apocynin(NADPH氧化酶抑制剂)或rotenone(线粒体氧化酶抑制剂)抑制(P<0.05).结论:衰老HUVECs分泌的EMPs多于年轻HUVECs;衰老HUVECs分泌的EMPs可导致年轻HUVECs早衰,其机制可能与EMPs通过激活NADPH氧化酶及线粒体氧化酶,进而诱导细胞内ROS水平增高有关.