1,25(OH)2D3及其类似物对人骨肉瘤细胞系HOS-8603增殖分化调节作用的分子机制

摘要

@@ 目的:研究维生素D3受体(VDR)及其靶基因p21在1,25(OH)2D3及其类似物调节人骨肉瘤细胞系HOS-8603增殖分化中的作用.方法:构建VDR反义cDNA的真核表达载体,用Lipofectamine法转染人骨肉瘤细胞系HOS-8603,经G418筛选后获得稳定转染的单克隆细胞株(VDRasl～6),并采用免疫组化方法和瞬时转染报告基因技术分别检测VDRas3细胞内源性VDR蛋白的表达情况和转录激活功能;继而利用VDRas3细胞研究VDR被阻断后细胞增殖以及靶基因p21 mRNA表达的变化.用定量RT-PCR法检测1,25(OH)2D3对p21 mRNA表达的诱导作用;构建p21真核表达载体(pcDNA3-p21)并稳定转染HOS-8603细胞(细胞株命名为HOS-p21),Western blot法鉴定HOS-p21细胞内p21蛋白的表达情况;采用组织化学染色法检测细胞内碱性磷酸酶(AKP)的表达,观察该细胞的生长情况并绘制生长曲线.结果:VDRas3细胞内源性VDR蛋白的表达量低于对照细胞;1,25(OH)2D3作用72 h后,对照细胞的报告基因CAT转录活性增加约3.5倍,而VDRas3细胞CAT的转录基本不受激素诱导;在内源性VDR被阻断后,1,25(OH)2D3及其类似物对细胞增殖的抑制作用以及对VDR的靶基因p21 mRNA表达的诱导作用均明显减弱.1,25(OH)2D3作用2 h即可诱导HOS-8603细胞内源性p21的表达,4 h达高峰,24 h仍未回降.细胞过度表达p21后生长速度明显减慢,培养6 d时细胞数为未转染细胞的50%;并且组织化学染色结果表明细胞的分化标志性抗原碱性磷酸酶的表达明显增强.结论:1,25(OH)2D3及其类似物对HOS-8603细胞增殖抑制作用是由VDR介导的.1,25(OH)2D3对p21 mRNA诱导作用可能是激素调节细胞增殖分化的重要机制之一.