钙激活钾通道参与重症失血性体克大鼠肠系膜细动脉平滑肌细胞膜的超极化

摘要

目的：血压降低、血管反应性低下是导致创伤、脓毒性等休克病 人死亡的重要原因之一。我 室曾提出了致血管反应性降低的细胞膜超极化理论，并报道了ATP敏感钾通道在血管反应性 低下中的作用：认为随着休克的发展，组织细胞缺血、缺氧加重，ATP耗竭，细胞内乳酸堆 积，从而激活了ATP敏感钾通道，使细胞膜超极化，血管舒张。除ATP敏感钾通道外，在微动 脉平滑肌细胞中还有两种钾通道，即：内向整流钾通道(Kir)和钙激活钾通道(Kca)。 其中钙激活钾通道(Kca)在血管平滑肌细胞上尤其丰富，而且在血管平滑肌细胞的肌 源性调节中起着重 要的作用。本文目的在于进一步阐明钙激活钾通道在休克大鼠肠系膜细动脉平滑肌细胞膜超 极化中的作用，从而为临床治疗提供理论基础。rn 方法：实验用Wistar大鼠，雌雄兼有，体重200+10 g。大鼠以13.3％乌拉坦＋0. 5 %氯醛糖肌肉麻醉，双侧股动脉插管，一侧用于测量血压，另侧用于放血，血压维持在38-40 mmHg 2 h，复制失血性休克大鼠模型。对照组只做手术，不放血。手术毕的动物放血除死 ，立即取 肠系膜动脉置于0℃的HPSS(mmol/L：NaCl l30，KCl 5，CaCl2 l.5，MgCl2 l.2，HEP ES l0，G1ucose l0，pH 7.2-7.4)液中，小心剥去周围脂肪组织，分离出肠系膜A2、A3 动脉(直径约 80-150 μm)，平衡30 min后，用1 g／L Pronase E 37 ℃温浴消化15-30 min，机械吹 打出单个平 滑肌细胞。细胞悬液滴入17 mm×17 mm的盖玻片上，细胞贴壁后，将盛有细胞的盖玻片用浴 槽液 冲洗后放入浴槽中，选用舒张态、边缘清晰的细胞进行膜片钳实验。膜片钳实验采用细胞贴 附式和内面向外式的单通道电流记录法。电极液成分为mmol/L：KCl l40，MgCl2　l.0， HE PES l0，EGTA 0.5，CdCl2 0.3，pH7.2-7.4，根据需要加入不同的CaCl2以调节自 由Ca 2+浓度；浴槽液用生理的HPSS液。由于电极液与细胞内液无K+浓度梯度，而浴槽液为 生理溶液，根据公 式I＝g(Vm-Vp)(其中I为单通道电流，g为电导，Vp为电极电压，Vm为静息膜电位)，用细胞 贴附式记录时，当电流为零时，Vp等于Vm，即可通过所给予的电极电压算出细胞的膜电位。 实验采用的电极电阻为8-10 MΩ，封接电阻大于2 GΩ，放大器(CEZ-2400，NIHON KOHDEN ， 日本)探头反馈电阻为50 G，低通滤波频率为2 kHz，实验数据记录和分析用Pclamp7.0(A xon ，美国)。结果：1.Kca通道的鉴定：实验记录的通道具有电压依 赖性、高度的K+选择性、对胞外TEA 的敏感性和胞内Ca2+浓度的依赖性，据此可以鉴定实验中所记录的通道为钙激活钾通 道。2. Kca通道的变化与休克后细胞膜电位超极化：对照组(n＝7)的I-Vp曲线 方程式 为I＝0.073Vp+2.8528；而休克组(n=8)为I=0.058Vp+4.5672，由此算出正常组肠系 膜平 滑肌细胞膜电位为-39.0 mV，休克组为-78.4 mV。静息(钳制电压为零)时，休克组KC a通道电流(3.36±l.17 pA)明显高于对照组(2.27±l.86 pA)。结论和讨论：由以上实验结果可以得出：1.在重症失血性休克时，大鼠肠 系膜细动脉平滑肌细胞膜发生了超极化：2.Kca通道参与了休克时细胞膜的超极化 。rn 测量膜电位的方法有多种，如细胞内直接记录法、荧光标记法等。曾有报道在脓毒性休 克和失血性休克时动脉平滑肌细胞膜发生了超极化，我室前期工作也证明失血性休克大鼠肠 系膜平滑肌细胞膜发生了超极化，但对于超极化产生的直接原因一直没有阐明。本文采用的 膜电位记录法不仅阐明了休克后细胞膜电位产生了超极化，从而引起血管平滑肌反应性降低 ，同时也证明，Kca在休克后膜电位的变化中起着一定的作用。