PKCα-NLRP3信号通路在小鼠急性肺损伤过度炎症反应中的作用机制

摘要

目的:研究细胞焦亡在脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)过度炎症反应中的作用,并探讨蛋白激酶Cα(PKCα)-核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路在细胞焦亡发生发展中的调节机制。方法:(1)雄性C57BL/6J小鼠经腹腔注射0.15 mg/kg钙磷蛋白C(calphostin C)干预PKCα表达,经气道内滴注LPS(10 mg/kg)构建ALI模型,设置对照组、calphostin C组、LPS组和LPS+calphostin C组,每组12只。检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子分泌和氧化应激活性,以及肺内细胞焦亡水平。(2)RAW264.7细胞分别用calphostin C(100 nmol/L)及活性氧(ROS)清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC;2.5 mmol/L)干预,再经1 mg/L LPS刺激建立细胞模型,设置对照组、LPS组、LPS+calphostin C组和LPS+NAC组。高内涵成像分析系统检测各组细胞内ROS水平,免疫荧光检测细胞硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)表达量,Western blot检测PKCα-NLRP3信号通路相关蛋白的表达。结果:(1)气道内滴入LPS诱导小鼠BALF中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-18和肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌水平显著升高,丙二醛(MDA)含量显著增加,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)活性显著降低(P<0.01),肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与LPS组相比,LPS+calphostin C组小鼠BALF中炎症因子水平显著降低(P<0.05),MDA含量显著减少,SOD和GSH活性显著增强(P<0.01),肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。(2)细胞模型中,与对照组相比,LPS组巨噬细胞ROS生成显著增加(P<0.01)。与LPS组相比,LPS+calphostin C组和LPS+NAC组巨噬细胞ROS水平显著降低(P<0.01),TXNIP表达下调(P<0.01),NLRP3、cleaved caspase-1和含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)蛋白水平降低,IL-1β和IL-18分泌减少(P<0.01)。结论:PKCα通过介导TXNIP-NLRP3信号通路而调控细胞焦亡过程,从而参与小鼠ALI中的过度炎症反应。