新型光遗传学工具Channelrhodopsin-XXM2.0和 PsCatCh2.0恢复视觉功能的可行性分析

摘要

目的探讨新型光遗传学工具Channelrhodopsin-XXM2.0 （XXM2.0）、Channelrhodopsin-PsCatCh2.0 （PsCatCh2.0）的光敏感性及动力学特征, 分析其是否可用于光遗传学视觉功能的恢复。方法通过分子生物学技术将XXM2.0和PsCatCh2.0的基因片段连接到包含抗氨苄青霉素筛选基因和报告基因的载体pCIG （c）-msFoxn3上, 形成新质粒pCIG （c）-msFoxn3-XXM2.0、pCIG （c）-msFoxn3-PsCatCh2.0。将构建的新质粒转染到HEK 293T细胞上, 用HEKA膜片钳系统行全细胞模式记录对光反应。在2.7×1016、4.7× 1015、6.4×1014 photons/ （cm2·s）的光强下记录电流大小;在2.7×1016 photons/ （cm2·s）光强下刺激XXM2.0、PsCatCh2.0并让其充分恢复, 在Clampfit 10.6软件中分析开放和关闭时间常数;在相同光强下, 设置2～ 32 Hz的光脉冲刺激, 记录XXM2.0、PsCatCh2.0的响应情况, 并在重复光刺激后间隔4000 ms和200 ms来分析电流衰减情况。组间比较均采用独立样本t检验。结果在XXM2.0、PsCatCh2.0序列两端引入限制性内切酶位点EcoRⅠ和EcoRⅤ, 酶切后通过T4 DNA连接酶成功构建新质粒pCIG （c）-msFoxn3-XXM2.0和pCIG （c）-msFoxn3-PsCatCh2.0, 并转染表达在HEK 293T细胞上。XXM2.0和PsCatCh2.0均表现出光强依赖性, 光强越大电流越大。在视网膜安全阈值内的光强6.4×1014 photons/ （cm2·s）刺激下, XXM2.0和PsCatCh2.0仍产生较大电流, 分别为（92.8±142.0）、（13.9±5.6）pA;两者比较, 差异无统计学意义（t=1.24、1.24, P=0.28、0.29）。XXM2.0、PsCatCh2.0的开放时间常数分别为（23.9±6.7）、（2.4±0.8）ms, 关闭时间常数分别为（5 803.0±568.2）、（219.9±25.6）ms;两者比较, XXM2.0开放时间常数、关闭时间常数均较PsCatCh2.0大, 差异均有统计学意义（t=7.10、31.60, P=0.00、0.00 ）。在响应频率方面, XXM2.0和PsCatCh2.0均能很好地响应32 Hz的高频率脉冲光刺激, 并在较长时间（4000 ms）和较短时间（200 ms）间隔的重复光刺激后均保持较小的电流衰减率。结论 XXM2.0和PsCatCh2.0均可在对视网膜安全的光强条件下被激活, 并都能以较低的电流衰减来响应高频率（至少32 Hz）的脉冲光刺激, 均满足利用光遗传学来恢复视觉功能所需的光敏蛋白特性。