肝素结合表皮生长因子抑制剂对卵巢上皮性癌紫杉醇耐药的逆转作用及其机制

摘要

目的探讨肝素结合表皮生长因子（HB-EGF）抑制剂CRM197对卵巢上皮性癌（卵巢癌）紫杉醇耐药的逆转作用及可能机制。方法 （1）四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测CRM197作用后卵巢癌紫杉醇耐药细胞系A2780/Taxol细胞对紫杉醇的50%抑制浓度（IC50）;蛋白印迹法及实时PCR技术分别检测CRM197作用后A2780/Taxol细胞中HB-EGF、表皮生长因子受体（EGFR）、P糖蛋白（P-gp）蛋白及多药耐药基因（MDR1）mRNA的表达。（2）构建MDR1小分子RNA（siRNA）质粒并转染A2780/Taxol细胞, 实验分为4组, 即空载体组、MDR1 siRNA组、空载体+CRM197组、MDR1 siRNA+CRM197组, 检测4组A2780/Taxol细胞中P-gp功能[以P-gp的底物若丹明123（Rh123）的荧光强度表示]和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白活性[以4硝基苯胺（pNA）浓度表示]。（3）建立卵巢癌A2780/Taxol细胞的裸鼠移植瘤模型, 免疫组化SP法检测CRM197作用后裸鼠移植瘤组织中EGFR和P-gp蛋白的表达。结果 （1）MTT比色法检测显示, CRM197作用后A2780/Taxol细胞对紫杉醇的IC50为（6.4±0.3）μmol/L, 明显低于未经CRM197作用的A2780/Taxol细胞[（34.1±0.5）μmol/L;P＆0.01], CRM197对紫杉醇的耐药逆转倍数为5.3。蛋白印迹法检测显示, CRM197作用后A2780/Taxol细胞中HB-EGF、EGFR、P-gp蛋白的表达水平（分别为1.44±0.29、0.71±0.25、0.82±0.19）均明显低于未经CRM197作用的A2780/Taxol细胞（分别为2.72±0.32、1.87±0.31、1.84±0.27, P均＆0.05）;实时PCR技术检测显示, CRM197作用后A2780/Taxol细胞中MDR1 mRNA的表达水平（0.79±0.13）也明显低于未经CRM197作用的A2780/Taxol细胞（1.78±0.27, P＆0.05）。（2）空载体组、MDR1 siRNA组、空载体+CRM197组、MDR1 siRNA+CRM197组A2780/Taxol细胞中的Rh123平均荧光强度分别为33.4±1.6、56.3±3.3、43.5±3.1、100.4±7.4, 细胞中pNA浓度分别为（11.4±1.2）、（52.8±0.9）、（71.2±3.6）、（82.7±3.8）μmol/L, 上述指标均为MDR1 siRNA+CRM197组高于空载体+CRM197组, 空载体+CRM197组、MDR1 siRNA组均高于空载体组, 分别比较, 差异均有统计学意义（P＆0.05）。（3）免疫组化SP法检测显示, CRM197作用后的A2780/Taxol细胞裸鼠移植瘤组织中EGFR、P-gp蛋白的表达水平分别为（4.4±1.4）、（3.8±1.1）分, 明显低于未经CRM197作用的A2780/Taxol细胞裸鼠移植瘤组织[分别为（10.2±3.1）、（8.8±2.7）分, P＆0.05]。结论 HB-EGF抑制剂CRM197可逆转卵巢癌紫杉醇耐药, 其作用机制可能与CRM197抑制EGFR/MDR1/P-gp通路、增加caspase-3活性, 从而促进耐药细胞凋亡相关。