小鼠4-1BB-Fc分子的真核表达及其体外抑制T细胞增殖的效应

摘要

目的 克隆并构建含小鼠4-1BB胞外段和人IgG Fc融合基因的真核表达质粒,表达具有生物学活性的4-1BB-Fc融合蛋白,初步探讨其体外生物学效应.方法 借助RT-PCR技术,从小鼠脾脏总RNA中扩增4-1BB全长编码基因,并导入克隆载体pGEM-T Easy.经测序证实,用PCR扩增其膜外区cDNA,酶切后与hIgG1 Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3.1中.应用脂质体将重组子pcDNA3.1-4-1BB-Fc转染COS-7及CHO细胞,经G418筛选,获得稳定表达4-1BB-Fc融合蛋白的CHO细胞株.双抗体夹心ELISA检测融合蛋白表达,经蛋白A亲和层析纯化,借助免疫印迹进行鉴定.应用FACS检测融合蛋白与DC细胞系DC2.4表面4-1BBL结合情况.采用MTT及CFSE(羧基荧光素乙酰乙酸)标记法检测4-1BB-Fc融合蛋白对同种异基因小鼠T细胞增殖的抑制作用.结果 经测序证实,所克隆和构建的小鼠4-1BB-Fc cDNA阅读框及连接部位序列正确;ELISA与免疫印迹证实4-1BB-Fc蛋白的表达及其对T细胞增殖具有明显抑制作用.结论 成功构建4-1BB-Fc融合基因并获稳定表达,可望用于探讨4-1BB参与移植排斥的作用及其机制,并为研究4-1BB-Fc的其他生物学作用奠定初步基础.