肠道病毒71型嵌合体病毒感染性克隆的构建与鉴定

摘要

目的构建含有弱毒株（SDLY 1株）2A、3B基因片段的强毒株（SDLY 107株）的嵌合体病毒,为进一步研究EV71的毒力建立初步的反向遗传操作平台。方法利用重叠PCR的方法,获得2A、3B基因片段,双酶切后置换到含有SDLY 107株全长的质粒pMD19-T中,利用体外转录获得感染性RNA,转染Vero细胞,成功拯救病毒后经PCR、免疫荧光和免疫印迹对其进行鉴定,测序验证,CCID50和空斑试验测定病毒的滴度。结果成功构建了嵌合体病毒SDLY 107-2A-1和SDLY107-3B-1感染性克隆,其转染Vero细胞后可观察到典型的细胞病变,PCR试验、间接免疫荧光和免疫印迹试验均证明EV71感染性克隆构建成功,CCID50和空斑试验测得嵌合体病毒SDLY 107-2A-1和SDLY107-3B-1的滴度分别为1.25×10~5PFU/ml和0.7×10~5PFU/ml。结论成功拯救了嵌合体病毒SDLY107-2A-1和SDLY 107-3B-1,其对细胞病变效应与亲本病毒SDLY 107株相似,为进一步在细胞和体内试验中测定病毒的毒力提供基础研究。