实时荧光定量PCR技术快速评价恒河猴外周血SIV病毒储存库的方法学建立

摘要

目的实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR）技术快速评估恒河猴外周血细胞中的猴免疫缺陷病毒（SIV）病毒储存库的方法学及初步应用。方法以SIVmac239毒株序列为标准, 在gag保守区设计1对引物和TaqMan探针, 用于实时定量PCR扩增。EcoRⅠ和SpeⅠ酶切含有SIVmac239毒株5’’端长片段（含SIV-gag区）的质粒p239SpSp5, 得到长度为2 090 bp的SIV-gag区保守片段, 纯化后定量系列标准品以绘制标准曲线。测定SIVmac239毒株感染恒河猴急性期和慢性期的外周血单个核细胞中SIV DNA拷贝数以反映病毒储存库水平, 并分析该水平在不同感染状态中的病毒学特征。结果标准品浓度在10～1010拷贝/μl之间与Ct值呈线性正相关。SIV急性期感染14～22 d可测出高水平的SIV病毒DNA, 急性期病毒DNA水平高于慢性期1～2个log水平。相同动物样本的每106个细胞中的病毒DNA水平较其血清中病毒载量低将近1个log左右。SIV病毒DNA水平与病毒载量比值（DNA/RNA）在慢性感染期显著高于急性期。结论本研究制备的SIV病毒DNA荧光探针定量RT-PCR方法特异性、敏感性高, 线性范围广, 可用于评估猴免疫缺陷病毒潜伏的病毒储存库水平。