人CD40-Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达与纯化研究

摘要

目的 建立稳定表达CD40 Ig融合蛋白的工程细胞株 ,获得大量融合蛋白以研究靶向阻断CD40∶CD40L途径防治移植物抗宿主病 （GVHD）策略的应用潜力。方法 自真核瞬时表达载体pIG 40Ig中切下CD40 Fc融合基因 ,插入pcDNA3.1载体中构建稳定表达载体。利用脂质体Lipo fectamine将该载体转染CHO细胞 ,G418筛选抗性克隆 ;夹心ELISA法检测上清中CD40 Ig融合蛋白的表达 ;Westernblot法鉴定其免疫学活性。利用有限稀释法对筛选出的混合克隆单克隆化。滚瓶法无血清大批培养工程细胞 ,ProteinA亲和层析法纯化 ,SDS PAGE后薄层扫描分析纯度。利用流式细胞术检测该蛋白与Jurkat细胞表面CD40L的结合功能。结果 CD40 Fc融合基因插入pcDNA3.1载体后构建成功稳定表达载体p3.1 40Ig ,转染CHO细胞后经 2次克隆化获得稳定表达CD40 Ig融合蛋白的基因工程细胞株 ,命名为B2。ProteinA亲和层析纯化后融合蛋白纯度达 95 %以上 ,该融合蛋白可特异结合Jurkat细胞表面的CD40L。结论 CD40 Ig融合蛋白可模仿天然分子与其配基结合 ,为研究靶向CD40∶CD40L途径的治疗制剂在防治GVHD中的潜在应用提供了有用的工具。