酶切富集联合DHPLC检测肿瘤患者外周血EGFR和KRAS基因突变及其临床应用

摘要

目的建立一种REDE-DHPLC检测外周血肿瘤游离核酸EGFR、KRAS基因突变的方法,并探讨其临床应用价值。方法采用限制性内切酶MseⅠ、MscⅠ、BstNⅠ和BglⅠ分别切断EGFR基因第19、21号外显子和KRAS基因第12、13号密码子的野生型片段以富集突变片段,建立检测血浆EGFR和KRAS基因突变的REDE-DHPLC法,并采用50%、10%、5%、1%和0.1%稀释度的质粒标准品评价REDE-DHPLC法和传统DHPLC法的检测灵敏度。然后,采用REDE-DHPLC法检测120例NSCLC和120例结直肠癌患者血浆和石蜡组织标本中的EGFR和KRAS基因突变。同时,用传统DHPLC法和测序法进行平行检测,以评价REDE-DHPLC法检测NSCLC和结直肠癌患者血浆中2个基因突变的诊断效能。结果 REDE-DHPLC法对EGFR和KRAS基因4个突变位点检测的灵敏度均达0.1%,传统DHPLC法检测灵敏度均为1.0%,REDE-DHPLC法对含0.1%突变的质粒标准品重复2～3次检测均为阳性。REDE-DHPLC法、传统DHPLC法和测序法检测120例NSCLC患者血浆EGFR基因总突变率分别为27.5%、16.7%和12.5%,检测120例结直肠癌患者血浆KRAS基因总突变率分别为38.3%、25.8%和16.7%。REDE-DHPLC法检测EGFR和KRAS基因总突变率均高于传统DHPLC法（x~2值分别为4.092、4.301,P均＜0.05）和测序法（x~2值分别为8.438、14.127,P均＜0.05）;将REDE-DHPLC法检测EGFR和KRAS基因突变与传统DHPLC法相比,敏感度均为100%（20/20,31/31）,特异度分别为87.0%（87/100）和83.2%（74/89）;与测序法相比,敏感度均为100%（15/15,20/20）,特异度分别为82.9%（87/105）和74.0%（74/100）。REDE-DHPLC法与传统DHPLC法检测EGFR、KRAS基因突变的符合率分别为89.2%（107/120,Kappa=0.690,P＜0.05）和87.5%（105/120,Kappa=0.718,P＜0.05）。REDE-DHPLC检测血浆与组织标本中EGFR和KRAS基因总突变符合率分别为91.7%（33/36,Kappa=0.939,P＜0.05）和90.2%（46/51,Kappa=0.914,P＜0.05）。结论 REDE-DHPLC法灵敏度和特异性高,结果易判读,且可有效避免纯合点突变漏检,有望成为临床实验室外周血EGFR和KRAS基因突变检测的推广方法。