人胎肝非实质间充质干细胞体外诱导分化为类肝细胞

摘要

目的体外诱导人胎肝非实质间充质干细胞（NPMSCs）分化为类肝细胞,对类肝细胞进行分子生物学及功能鉴定。方法采用体外细胞培养技术,分离培养人胎肝NPMSCs,在1%基质胶作基质,2.5 mmol/L氮胞苷预处理10～12 h,肝细胞生长因子10μg/L加成纤维细胞生长因子4 10μg/L加肝细胞生长培养基中诱导。用显微摄像和四甲基偶氮唑盐研究细胞增殖及生长特征,用流式细胞仪、免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应鉴定细胞表型。采用酶联免疫吸附法检测培养上清液中人Alb水平,过碘酸希夫试验进行糖原染色。结果从人胎肝获得贴壁细胞种植后生长分裂良好,连续传10代后,每份人胎肝NPMSCs可扩增达109个细胞。NPMSCs表型为CD166阳性,CD34阴性。在添加成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子的基质胶上诱导培养的NPMSCs在21～28 d时,形态由长梭形变为三角形、多角形或类圆形。细胞转圆率为40%,双核细胞比率5%。免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应检测显示未诱导培养的NPMSCs中,有较少的细胞表达甲胎蛋白及其mRNA,未见其他肝脏特有的转录因子或者细胞质蛋白标志。诱导早期可见较多细胞表达GATA4、甲胎蛋白和CK18及其mRNA,至诱导后期表达下降,而Alb、CK18、谷胱甘肽S转移酶-π和肝细胞核因子1α表达逐渐上升。Alb、CK18阳性细胞比例达60%。未诱导分化的NPMSCs不分泌Alb,诱导分化的NPMSCs以时间依赖方式产生Alb。NPMSCs诱导14d时首先见到部分细胞出现红紫色染色的糖原积聚物,28 d后阳性染色细胞数量增多。结论在本实验诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞。诱导后NPMSCs已具备肝细胞特有的功能性特征。