人骨髓来源多能成体祖细胞与人肝细胞系L02体外共培养向肝样细胞分化的实验研究

摘要

目的探索人骨髓来源多能成体祖细胞（hMAPCs）在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性,为其在组织工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。方法（1）取健康成人志愿者适量骨髓采用CD45、糖化蛋白A（GlyA）免疫微磁珠负分选,纯化培养CD45、GlyA hMAPCs。（2）间接共培养:将分别接种于盖玻片上的传代hMAPCs和人肝细胞系L02（密度均为1×105/ml）按照各50%比例共置于直径10 cm培养皿中,培养液共通,实现间接共培养。分别于第1、3、5、7天免疫细胞化学鉴定hMAPCs的Alb、AFP、细胞角蛋白18（CK18）、细胞角蛋白19（CK19）等肝细胞特征性表型表达变化情况,并设阳性对照（单独培养的L02细胞）和阴性对照（单独培养未经诱导的hMAPCs）,计数阳性细胞比率。（3）直接共培养:将CFSE荧光（绿色）标记的hMAPCs与L02（密度均为1×104/ml）按照各50%比例混合后接种于激光共聚焦显微镜检查专用培养皿内,实现直接共培养。5 d后用SABC-Cy3免疫荧光（红色）双标后在激光共聚焦显微镜下分别观察hMAPCs表达Alb、AFP、CK18的情况。同样设阳性对照（单独培养的CFSE标记L02细胞）和阴性对照（单独培养的CFSE标记MAPCs）。镜下表达黄色荧光的细胞即是向肝细胞分化的MAPCs,为阳性细胞;单纯表达绿色荧光的细胞为未分化的MAPCs;单纯表达红色荧光的细胞为L02细胞。结果（1）间接共培养结果:AFP作为不成熟肝细胞的表型标志,在间接共培养第1天表现为强阳性表达,随后逐渐减弱,至第7天,AFP的阳性表达已经很少。而Alb在第1天有可疑阳性表达,第3天,Alb即出现较强的阳性表达,第5天,Alb的阳性表达就达到高峰,第7天,密集生长的细胞仍广泛的阳性表达Alb。第1、3天检测CK18均为阴性,至第5天CK18开始出现阳性表达,第7天CK18阳性表达较前增强。CK19在各时间点均为阴性着色。阳性对照细胞Alb及CK18有较强的阳性表达,AFP弱阳性表达,CK19阴性表达。阴性对照细胞均为阴性表达。（2）直接共培养结果:Alb和CK18检测时,较多细胞质内出现黄色荧光表达,而AFP阳性荧光表达则仅出现在极个别细胞质内,该结果与阳性对照细胞荧光表达类似,而阴性对照细胞未见有阳性荧光表达。结论（1）与人肝细胞系L02间接共培养能够诱导人骨髓来源的MAPCs向成熟肝样细胞定向分化。（2）与人肝细胞系L02直接共培养能够诱导人骨髓来源的MAPCs向成熟肝样细胞定向分化,且时间有提前趋势。