微小RNA-137调控Notch1基因介导自噬在肝癌细胞增殖和迁移中的作用

摘要

目的探讨微小RNA-137（miR-137）调控Notch1基因并介导自噬对肝癌细胞增殖和迁移的影响。方法体外培养人SMMC7721肝癌细胞系,用miR-137模拟物、miR-137抑制物以及Notch1基因的干扰RNA（siRNA）转染细胞,分为正常对照组（NC组）、miR-137模拟物组、miR-137抑制物组、Notch1 siRNA组。采用实时定量-PCR（RT-PCR）检测SMMC7721细胞转染后miR-137与Notch1mRNA的表达。细胞迁移实验（Transwell）分析miR-137及Notch1基因对SMMC7721细胞迁移侵袭的影响。细胞免疫组化观察SMMC7721细胞β-链蛋白（β-catenin）和波形蛋白（vimentin）的表达情况,自噬双标腺病毒检测SMMC7721细胞自噬体个数的变化。采用蛋白印迹法（Western blot）检测Notch1基因、上皮型钙黏蛋白（E-Cadherin）、神经型钙黏蛋白（N-Cadherin）、vimentin、选择性自噬接头蛋白（P62）及微管相关蛋白1轻链3（LC3）的表达。结果实时荧光定量PCR（RT-PCR）结果显示miR-137抑制物组Notch1基因的相对表达含量（5.71±0.45）明显高于miR-137模拟物组（0.21±0.06）,差异有统计学意义（P＜0.05）。Transwell实验显示miR-137模拟物组（66.00±4.55）和Notch1siRNA组（88.00±6.78）肝癌细胞侵袭转移的个数较miR-137抑制物组（515.00±35.12）明显降低（P＜0.05）。细胞组化检测显示miR-137模拟物组及Notch1 siRNA组β-catenin表达明显增加且vimentin表达明显下降（P＜0.05）。自噬双标腺病毒检测结果显示miR-137模拟物组自噬体数量（5.50±3.70）明显低于miR-137抑制物组（32.75±4.11）,差异有统计学意义（P＜0.05）。Western blot检测显示,与miR-137抑制物组、NC组比较,miR-137模拟物组Notch1基因、N-Cadherin、vimentin和LC3表达水平明显降低,E-Cadherin、P62表达水平明显增高。Notch1 siRNA组Notch1基因、N-Cadherin、LC3表达水平明显低于NC组,E-Cadherin、P62表达水平明显高于NC组。结论 miR-137可通过抑制Notch1基因的表达抑制自噬从而抑制肝癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭,有可能成为肝癌治疗的新靶点。