高压尾静脉注射和位点特异性整合介导的人凝血因子Ⅸ基因治疗血友病B小鼠

摘要

目的通过高压尾静脉注射将携带attB和人凝血因子Ⅸ（hFⅨ）的质粒与表达phiC31的质粒共同导入血友病B小鼠肝脏细胞,检测目的质粒能否整合入小鼠基因组并持续表达。方法①构建表达hFⅨ并携带attB核心序列的真核表达载体attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP,并在体外验证该载体能否表达目的基因。②用高压尾静脉注射法将该载体与表达phiC31的质粒CMV-int共注入血友病B小鼠,attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP单独注射为对照。③ELISA的方法检测hFⅨ在其体内的表达;用出血时间评价血友病小鼠出血症状是否改善;用巢式PCR检测attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP是否整合到基因组的整合热点mpsL1（mouse pseudo-site from liver 1）位点。结果经鉴定,attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP载体构建成功,并在体外表达hFⅨ。高压尾静脉注入血友病B小鼠24 h后,hFⅨ血清水平达到最高值为（1533±239）ng/ml,此时小鼠的出血症状明显改善。但是不论是否与CMV-int共注射,此后hFⅨ水平迅速下降,在注射后10d内降到本底水平。巢式PCR的结果证实,attB-hFⅨ-pIRES2-EGFP整合到小鼠肝脏基因组的mpsL1位点。结论 phiC31可以将34 bp的attB最短序列整合到小鼠基因组的整合热点mpsL1;由CMV启动hFⅨ的能够瞬间高表达并有效改善血友病小鼠的出血症状;但是外来DNA进入细胞后,无论是否整合到基因组均被迅速沉默,说明肺脏和肝脏对整合入基因组的CMV启动子表达调控的机制不尽相同,因此对用于基因治疗的裸DNA进行改进使其适合在靶器官表达是十分必要的。