microRNA125对无义突变的人凝血因子Ⅸ基因调控的分子机制

摘要

目的构建人凝血因子Ⅸ小基因（Mini-hF9）及无义突变体,检测其mRNA表达水平,分析microRNA125对无义突变的F9基因表达调控的分子机制。方法利用PCR定点突变技术构建若干无义突变的人Mini-hF9并转染哺乳动物细胞HEK293T等,同时转染miR-125模拟物,通过实时荧光定量PCR（q-PCR）检测Mini-hF9基因mRNA表达水平。结果成功构建了Mini-hF9并在细胞中正确剪接。成功构建了无义突变体M1（nt 34 G＞T in Exon 7）、M2（nt 52 G＞T in Exon 7）和M3（nt 85 G＞T in Exon 7）。M1和M2突变体中Mini-hF9基因mRNA表达水平分别为野生型的14.1%（t=15.464,P=0.004）和22.4%（t=15.755,P=0.004）,通过放线菌酮处理实验证实这是由于无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay,NMD）所致。分别转染miR-125a模拟物和miR-125b模拟物后,M1突变体中Mini-hF9基因mRNA水平分别升高到1.70倍（t=-4.883,P=0.039）和2.40倍（t=-17.537,P=0.003）,M2突变体Mini-hF9mRNA水平分别升高到2.02倍（t=-19.264,P=0.003）和2.07倍（t=-9.158,P=0.012）。结论无义突变发生的位置是触发NMD途径的一个关键因素;microRNA125能够通过抑制NMD途径提高无义突变的凝血因子Ⅸ的mRNA水平。