人骨膜细胞体外成骨分化的基因表达和功能检测

摘要

目的探讨并鉴定骨膜细胞经骨形成蛋白7（BMP7）诱导分化为成骨细胞的基因表达和细胞功能。方法成人胫骨骨膜常规体外细胞培养法,分实验组和对照组,分别加入BMP7加成骨辅助剂和单纯成骨辅助剂进行体外培养。CCK-8法检测细胞增殖活性,第5、10、15和20天分别采用Real Time-PCR检测骨钙素基因表达,ELISA法检测上清液碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OCN）及骨桥蛋白（osteopontin,OPN）的水平,甲苯胺蓝染色检测糖胺聚糖（GAG）,Real Time-PCR检测Ⅱ型胶原基因,比色法检测细胞ALP活性,ALP染色法检测ALP,Von Kossa染色法检测钙结节。结果两组骨钙素基因表达及上清液ALP、骨钙素、骨桥蛋白的含量均增高,实验组与对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。两组细胞的ALP和钙结节染色阳性率增高,实验组与对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。甲苯胺蓝染色阳性率及Ⅱ型胶原基因表达表现为先高后低,实验组与对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。结论骨膜细胞在BMP7诱导下体外大量增殖和分化成骨,表达出明显的成骨特异基因,并具有合成分泌成骨特异蛋白的功能;成骨化过程中,除直接分化成骨外,还存在部分细胞先经软骨形成再钙化成骨的现象;经骨膜细胞-BMP7途径在体外获取大量成骨细胞可用于组织工程的体外构骨及临床应用。