人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

摘要

目的探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1（Gabl）基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率。方法针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA（siRNA）序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gabl-RNA干扰（RNAi）转化子,聚合酶链反应（PCR）筛选阳性克隆并进行测序鉴定。将测序正确的Gabl-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gabl-RNAi慢病毒并测定其滴度。将获得的慢病毒分别转染EA-hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率。结果经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×10~9 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70%以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平（0.088±0.003）较对照（0.947±0.087）组和空白组（0.999±0.067）显著降低（P＜0.01）。结论成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达。