ILK-siRNA-AAV对大鼠青光眼滤过术后滤过通道瘢痕形成的抑制作用

摘要

目的观察整合素连接激酶-小干扰RNA-特异性腺相关病毒(ILK-siRNA-AAV)对大鼠青光眼滤过术后滤过通道瘢痕形成的抑制作用。方法选取SPF级8~9周龄SD大鼠48只,采用随机数表法将其分为空白对照组、ILK-siRNA-AAV组、NC-siRNA-AAV组和丝裂霉素C(MMC)组,每组12只。每只大鼠均取左眼为实验眼,右眼不做特殊处理。采用前房植入引流管法建立大鼠青光眼滤过术球结膜滤过泡模型,空白对照组、ILK-siRNA-AAV组和NC-siRNA-AAV组术后1 d滤过泡内分别注入磷酸盐缓冲液、ILK-siRNA-AAV和NC-siRNA-AAV各5μl,MMC组术中采用含0.4 mg/ml MMC的小棉片置于结膜瓣下5 min。术前及术后1、2、3、7、14、21、28 d,采用手持式眼压计测量术眼眼压;术后1、2、3、7、14、21、28 d,采用手术显微镜观察术眼滤过泡形成情况,采用Kaplan-Meier生存分析计算滤过泡生存天数;术后28 d,采用逆转录PCR及Western blot法检测术区结膜及结膜下组织中ILK的mRNA及蛋白表达,检测ILK基因沉默效应;采用苏木精-伊红染色观察ILK基因沉默对滤过通道组织形态的影响;采用Masson染色观察ILK基因沉默对球结膜滤过泡术区组织胶原纤维沉积作用,计算胶原纤维染色阳性面积占整个组织视野面积的百分比。结果各组大鼠手术前后不同时间点眼压总体比较,差异均有统计学意义(F_(分组)=76.84,P<0.001;F_(时间)=114.49,P<0.001),其中ILK-siRNA-AAV组术后第1、7、14和28天眼压均低于空白对照组,MMC组术后第2、3、7、14和28天眼压均低于空白对照组,ILK-siRNA-AAV组术后第7、14、21和28天眼压均低于NC-siRNA-AAV组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析结果显示,空白对照组、NC-siRNA-AAV组、ILK-siRNA-AAV组和MMC组滤过泡生存天数分别为(3.50±1.51)、(5.00±3.41)、(31.50±3.15)和(31.33±2.46)d,总体比较差异有统计学意义(F=395.83,P<0.05),其中ILK-siRNA-AAV组和MMC组滤过泡生存天数均多于空白对照组和NC-siRNA-AAV组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。各组ILK mRNA及蛋白相对表达量总体比较差异均有统计学意义(F=222.32、752.69,均P<0.05),其中ILK-siRNA-AAV组ILK mRNA及蛋白相对表达量明显低于空白对照组和NC-siRNA-AAV组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。苏木精-伊红染色结果显示,空白对照组和NC-siRNA-AAV组术区纤维结缔组织增生,细胞大量增生,成纤维细胞密度高,呈团块状生长;ILK-siRNA-AAV组球结膜较薄,纤维结缔组织排列疏松,少量成纤维细胞增生;MMC组结膜纤维层疏松、菲薄,形成空洞,细胞稀少。各组胶原纤维染色阳性面积百分比总体比较差异有统计学意义(F=741.66,P<0.05),其中与空白对照组比较,ILK-siRNA-AAV组和MMC组阳性染色百分比显著降低,ILK-siRNA-AAV组阳性染色百分比明显低于NC-siRNA-AAV组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论ILK-siRNA-AAV沉默ILK表达可抑制大鼠滤过术后滤过区组织瘢痕形成,降低眼压。