大鼠创伤性脑损伤后神经细胞凋亡的动态变化及其与caspase-3基因表达的关系

摘要

目的探讨创伤性脑损伤（TBI）后神经细胞凋亡的变化规律及其与caspase-3基因表达的关系。方法成年健康封闭群SD大鼠120只,随机分为对照组8只、损伤组和抑制物组各56只。Feeney法致伤,抑制物组伤后脑内注射5μg caspase-3抑制剂z-DEVD-fmk。分别在伤后1,6,24,48 h和3,7,14 d处死取材（每个分析时相点8只大鼠）,采集伤灶中心皮质、皮层下白质、海马、齿状回,以及对侧相应部位脑组织,应用原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸（dUTP）标记法（TUNEL法）和流式细胞术检测神经细胞凋亡的变化;免疫组化法、蛋白印迹（western blot）和半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）,检测caspase-3蛋白和mRNA的表达;并借助荧光分析试剂盒检测caspase-3活性的变化。所得数据采用SPSS 10.1统计软件包进行Spearman等级相关分析和方差分析（SNK-q检验）。结果伤后伤侧各脑区神经细胞凋亡指数（AI）和细胞凋亡百分率（AP）迅速增高,24～48 h达峰值,随后逐渐下降,但伤后14 d仍高于正常（P＜0.01）。伤后caspase-3蛋白和mRNA的表达明显增加,caspase-3活性迅速上升,峰值在24～48 h。其中伤后24 h伤侧海马区caspase-3蛋白谱密度与对照组相比增加1484%,caspase-3 mRNA的表达量增加1043%,caspase-3活性增加148%;伤后48h伤灶皮层下白质caspase-3蛋白谱密度增加1690%,caspase-3 mRNA的表达量增加1181%,caspase-3活性增加183%。Western blot显示,伤后caspase-3原酶及p17活性亚单位的表达均增强。抑制物组caspase-3蛋白和mRNA的表达均明显下降,caspase-3活性明显降低;同时,AI值和AP值也明显降低。统计学相关分析发现,伤后神经细胞凋亡与caspase-3 mRNA和蛋白的表达间呈正相关（r=0.821和r=0.638,P＜0.01）,伤后caspase-3在mRNA和蛋白水平的表达间呈正相关（r=0.945,P＜0.01）。结论急性TBI后神经细胞凋亡的发生与caspase-3的激活有关;神经细胞凋亡与其调节基因caspase-3的表达间具有一致性,TBI对caspase-3的调节发生在转录水平前的某一环节。caspase-3抑制剂能有效地阻断TBI后的神经细胞凋亡。