shRNA沉默神经导向分子5A基因对A375细胞系增殖、转移和侵袭能力的影响

摘要

目的探讨慢病毒介导短发夹RNA（shRNA）沉默神经导向分子5A（Semaphorin 5A）基因对恶性黑素瘤A375细胞系生物活性的影响。方法针对Semaphorin 5A设计2对shRNA引物及1对阴性对照引物, 构建慢病毒载体, 转染至人胚肾上皮HEK293T细胞系收获慢病毒, 利用慢病毒感染A-375细胞系并通过嘌呤霉素筛选, 成功获得稳定转染细胞系, 实验分为实验组细胞（A375-shRNA1和A375-shRNA2）、阴性对照组细胞（A375-con）及空白对照组细胞（A375）。通过反转录PCR（RT-PCR）、Western印迹比较实验组细胞、阴性对照组细胞及空白对照组细胞Semaphorin 5A mRNA、蛋白表达水平的差异。噻唑蓝（MTT）检测细胞生长情况;侵袭试验及划痕试验比较转染前后细胞的侵袭运动能力。结果 Semaphorin 5A成功转染A375细胞后, 经嘌呤霉素筛选, 成功获得稳定转染实验组A375-shRNA2细胞系及对照组A375-con。反转录PCR及Western印迹检测, 干扰后实验组A375-shRNA2较对照组A375-con、A375 Semaphorin 5A的转录水平及蛋白表达水平表达下调。MTT实验结果显示, A375-con与A375细胞生长差异无统计学意义（P ＆ 0.05）, A375-shRNA2细胞生长明显减慢, 与A375和A375-con比较, 差异均有统计学意义（P ＆ 0.05）。划痕实验结果显示, A375-shRNA2划痕处细胞无明显迁移, 划痕未得到修复, 而A375及A375-con划痕处细胞最终几乎将划痕覆盖。侵袭实验结果显示, A375组与A375-con组穿过的细胞数差异无统计学意义（P ＆ 0.05）;而A375-shRNA2通过小室的细胞明显少于A375及A375-con组, 差异有统计学意义（P ＆ 0.05）。结论慢病毒介导shRNA沉默Semaphorin 5A基因能使A375中的Semaphorin 5A有效下调, 并抑制细胞的生长, 降低细胞的侵袭以及运动能力。