利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠

摘要

目的 利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠.方法 针对miR-223基因设计双重sgRNAs,将体外转录的sgRNAs和Cas9 mRNA共同显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞.小鼠出生后取其基因组DNA进行PCR扩增和测序以鉴定基因型,同时取小鼠肝脏研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miR-223在肝脏中的表达.结果 设计了miR-223基因双重sgRNAs并对其进行了体外转录,纯化后显微注射小鼠受精卵细胞获得miR-223基因突变小鼠.测序结果表明突变小鼠有3种基因型,一种为6 bp的缺失突变,但未对miR-223序列产生影响;另外两种为162 bp和168 bp的缺失突变,完全删除miR-223前体和成熟区序列.与野生型相比,这两种小鼠肝组织中几乎不能检测到miR-223的表达.结论 设计双重sgRNAs并应用CRISPR/Cas9技术成功构建miR-223全基因敲除小鼠.