基因敲除小鼠

摘要： 目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建fto基因敲除小鼠模型,为FTO功能研究提供材料。方法:体外将Cas9 mRNA和靶向fto的向导RNA(guide RNA,gRNA)显微注射到小鼠受精卵中,通过聚合酶链式反应、扩增及产物测序、蛋白质印迹法对小鼠fto基因的敲除进行鉴定及验证。结果:成功将具有活性的gRNA载体和Cas9 mRNA注射入受精卵中,获得3只F0代阳性初建鼠。经同种小鼠杂交配种,最终得到fto基因敲除的纯合子小鼠。结论:通过CRISPR/Cas9技术成功制备了fto基因敲除小鼠模型,为进一步研究fto基因功能奠定了基础。

摘要： 目的研究羊毛固醇合成酶(LSS)基因功能缺失对小鼠生殖的影响。方法取8周龄的LSS^(+/+)(WT)型和LSS^(+/-)(KO)型鼠雌雄共30只鼠,分别按♂WT×♀WT、♂WT×♀KO、♂KO×♀WT、♂KO×♀KO分组进行1:1合笼,时长4个月,统计每胎生仔个数及平均产仔周期;取WT型和KO型小鼠的血清,进行性激素检测;用TUNEL染色观察睾丸中生精细胞的凋亡情况;用Western blot检测睾丸组织中Tubulin、LSS和凋亡相关蛋白(GPX4/Bax/Bcl-2)的表达。结果配繁结果显示♂WT×♀WT与♂KO×♀KO相比,每胎平均生仔个数差异有统计学意义,其余组别均无差异,产仔周期4组的差异均无统计学意义;WT型和KO型小鼠性激素检测结果相比,差异也无统计学意义;TUNEL染色结果可以观察到,基因敲除鼠的睾丸组织中生精细胞凋亡增多;Western blot结果中,与WT型相比,KO型小鼠的凋亡相关蛋白(GPX4/Bax/Bcl-2)表达量均无差异。结论LSS基因功能缺失会导致小鼠生精细胞凋亡增加,其可能影响小鼠的生育能力。

摘要： 目的应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统构建血管平滑肌缝隙连接蛋白Cx43条件性基因敲除小鼠(VSMC-Cx43^(-/-))模型。方法采用受精卵同源重组的方式,对Gja1基因进行flox修饰。通过体外转录的方式,获得Cas9 mRNA和gRNA;通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体,该载体包含3.0 kb 5’同源臂、1.9 kb的flox区域和3.0 kb 3’同源臂。将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,获得F0代小鼠。PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得3只阳性F1代小鼠(Cx43^(flox/+))。将获得的flox杂合子Cx43^(flox/+)小鼠自交,获得flox纯合子Cx43^(flox/flox)小鼠。然后用Cx43^(flox/flox)小鼠和Myh11-CreERT2小鼠交配,最终获得flox纯合且Cre阳性的实验组小鼠(该小鼠简写为:VSMC-Cx43^(-/-))和flox纯合且Cre阴性的对照组小鼠(Cx43^(flox/flox))。用PCR进行基因型鉴定,用Western blot技术检测Cx43在大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中的表达,以明确基因敲除小鼠是否构建成功。结果基因型鉴定、免疫荧光和Western blot检测结果表明VSMC-Cx43^(-/-)基因敲除小鼠模型构建成功,小鼠一般性状无改变,小鼠大脑中动脉、冠脉、肺动脉和肾动脉组织中Cx43蛋白表达均下降。因此,可作为长期稳定模型研究血管平滑肌Cx43的功能。结论应用CRISPR-Cas9技术和LoxP-Cre系统成功构建了VSMC-Cx43^(-/-)基因敲除小鼠模型,为深入研究Cx43在血管疾病中的作用提供工具。

摘要： 尽管基于QTL定位和关联分析研究挖掘了许多奶牛产奶性状候选功能基因,然而仅有少数几个基因经过体内外的功能验证。本课题组前期全基因组关联分析(GWAS)研究结果表明Vps28基因与奶牛产奶性状表型显著相关,并在奶牛乳腺组织中特异性高表达。为了深入了解该基因对泌乳性状的作用和功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了Vps28基因敲除小鼠,对其进行体内功能研究。研究结果显示Vps28基因敲除纯合型小鼠(Vps28-/-)极可能导致胚胎早期死亡,故只获得杂合型基因敲除小鼠(Vps28+/-)。敲除小鼠模型构建成功后,检测乳腺组织和脾脏组织中Vps28基因mRNA和蛋白的表达,结果显示与野生型小鼠(Vps28+/+)相比,Vps28+/-杂合型小鼠Vps28的mRNA和蛋白表达量均显著下降。进一步对母鼠的泌乳量、乳房形态和血常规进行检测,发现Vps28敲除母鼠的泌乳量下降,乳头明显凹陷,且血常规中白细胞数量、中性粒细胞数量、淋巴细胞数量和中间细胞数量显著低于野生型小鼠,推测Vps28基因不但影响泌乳,而且影响相关免疫性状。

摘要： Slc25a46-/-小鼠(KO小鼠)是一种线粒体代谢异常的动物模型.目前,较多关于该模型的研究忽略了宏量营养素对其生长状态的影响.本实验探究了不同营养素配比的日粮对KO小鼠生长状态的影响.分别给予KO小鼠和野生型C57BL/6小鼠(WT小鼠)两种不同营养素配比的日粮,直至KO小鼠全部死亡,通过测定小鼠的进食量、体质量、体温、抓力和寿命,反映营养素对小鼠生长性能的影响.结果显示,在给予高碳水化合物、高脂肪、低蛋白质日粮的情况下,KO小鼠的体质量保持稳定,寿命显著延长(P<0.05),并具有更大的抓力(P<0.05),但小鼠的进食量和体温变化不显著.然而与给予对照日粮的WT小鼠相比,给予高碳水化合物、高脂肪、低蛋白质日粮的WT小鼠的体质量显著降低,其他生长性能没有发生明显改变.碳水化合物、脂肪的补充可以在一定程度上拮抗小鼠的异常线粒体代谢,这表明合适营养素配比可以使代谢异常和基因敲除小鼠处于良好的生长状态,将有助于提高基于基因敲除小鼠模型所获得实验数据的科学性和可靠性.

摘要： 目的:构建髓细胞条件性METTL3基因敲除小鼠模型。方法:将Lyz2-cre^((+/+))雌性小鼠与METTL3^((flox/flox))雄性小鼠杂交,得到METTL3^((flox/-))Lyz2-cre^((+/-))杂合子小鼠,该杂合子小鼠自交,得到METTL3^((flox/flox))Lyz2-cre^((+/+))小鼠。提取小鼠鼠尾组织DNA,经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳和DNA序列测定,在DNA水平判断小鼠基因型;提取小鼠骨髓细胞RNA,利用RT-PCR法检验METTL3的敲除效率;利用成像流式细胞仪在蛋白水平分析髓细胞中METTL3的敲除效率。结果与结论:在DNA、RNA和蛋白水平分别验证了髓细胞条件性METTL3基因敲除小鼠模型构建成功,该小鼠存活并且可育,为研究METTL3在髓源抑制性细胞功能中的作用提供了研究平台。

摘要： 目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白核酸酶9(CRISPR-associated nuclease 9,Cas9)基因编辑技术构建稳定遗传的脂多糖结合蛋白(lipopolysaccaride binding protein,Lbp)基因敲除小鼠。方法根据C57BL/6J小鼠的Lbp基因序列特征,设计sgRNA靶点,删除Lbp基因5’-端蛋白编码保守序列并引入移码突变,使编码LBP失活。提取F0、F1、F2、F3代小鼠基因组,PCR鉴定并测序验证Lbp基因敲除效果,RT-PCR测序验证Lbp基因转录水平,蛋白质印迹法验证F2代LBP蛋白表达水平。结果F0代获得5只杂合子敲除小鼠(Lbp^(+/-))、F1代获得3只Lbp+/-小鼠,F2代获得4只Lbp纯合子敲除小鼠(Lbp^(-/-)),F3代获得30只Lbp^(-/-)小鼠。RT-PCR测序表明,Lbp^(-/-)小鼠mRNA缺失244 bp且发生移码突变,导致翻译提前终止。蛋白质印迹证明Lbp^(-/-)小鼠肝脏组织中无LBP蛋白表达。结论通过CRISPR/Cas9技术成功构建可以稳定遗传的Lbp基因敲除小鼠,为后续进一步研究LBP的免疫及其生理作用提供基础。

摘要： 目的探讨羊毛固醇合成酶(LSS)基因功能异常及胆固醇水平变化对大脑功能分子水平的影响。方法通过RNA-Seq分析LSS(+/-)小鼠及野生型(WT)C57BL/6小鼠基因的表达,KEGG富集分析差异基因涉及的信号通路。用实时定量PCR以及Western blot法检测差异基因的表达。结果通过RNA-Seq分析,LSS(+/-)杂合敲除导致小鼠大脑中320个基因表达出现变化,其中上调基因145个,下调175个,KEGG富集分析差异基因涉及神经活化的受体与配体通路、河马信号途径及谷氨酸能突触途径。实时定量PCR分析结果显示CCKBR与Htr5b分别出现上调。Western blot结果显示CCKBR基因在LSS(+/-)小鼠全脑组织总蛋白中明显高表达。结论LSS(+/-)杂合敲除会影响小鼠大脑功能及行为。

摘要： 目的:确定提高VASN基因敲除小鼠基因型检出率的方法.方法:根据VASN基因外显子设计2对gRNA,将Cas9和gRNA共注射入受精卵生产出F0代小鼠,将F0代小鼠进行近交繁殖产生F1代,分别用3种方法鉴定F1代小鼠基因型,比较3种方法的检出率.方法一:DNA提取试剂盒A+DNA高保真聚合酶a+PCR扩增条件1,鉴定16只小鼠;方法二:DNA提取试剂盒A+DNA高保真聚合酶b+PCR扩增条件2,鉴定14只小鼠;方法三:DNA提取试剂盒B+DNA高保真聚合酶b+PCR扩增条件3,鉴定9只小鼠.结果:Cas9和gRNA共注射入319枚受精卵,分5批移植,其中3批受孕成功,胚胎移植率为60.00％,共获得16只F0代小鼠,经过自交繁殖共获得39只F1代小鼠.分3批分别采用3种方法进行鉴定,方法一的基因型检出率为12.50％;方法二的基因型检出率为64.29％;方法三的基因型检出率为100.00％,且与测序结果吻合,电泳图无杂带.结论:DNA提取试剂盒B+DNA高保真聚合酶b+PCR扩增条件3的基因型鉴定检出率最高.

摘要： 目的 探讨钙感受器STIM1在小鼠主动脉平滑肌收缩反应中的作用.方法 采用Cre-lox重组技术制备平滑肌特异性STIM1敲除小鼠(sm-STIM1-KO);采用离体血管张力测定方法,测定sm-STIM1-KO小鼠主动脉对不同血管收缩剂反应,并给予不同的钙通道阻断剂,观察血管收缩变化.结果 sm-STIM1-KO小鼠制备成功.sm-STIM1-KO小鼠钙库操纵的钙通道(SOCC)介导的血管收缩消失;与野生型相比,sm-STIM1-KO小鼠对Phe、5-HT和U46619总的收缩反应无明显变化,但在有钙和无钙的K-H溶液中,经硝苯地平孵育后,两组血管收缩均被抑制,且sm-STIM1-KO小鼠收缩明显低于野生型小鼠(P<0.01);在含硝苯地平的高钾溶液中,Phe引起的快相收缩没有变化,慢相收缩下降(P<0.01);sm-STIM1-KO小鼠肌浆网钙释放介导的血管收缩达峰速度和下降速度明显加快(P<0.05).结论 STIM1是SOCC介导的血管收缩的必须组成成分,且参与肌浆网钙释放介导的血管收缩反应.

摘要： CBISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是新近出现的一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术.最初的研究发现CRISPR/Cas9是细菌的免疫防御机制,细菌通过CRISPR/Cas9系统可将入侵的病毒DNA或其它外源DNA降解从而达到免疫防御的目的.CRISPR系统共分3类,其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而Ⅱ类只需一种Cas蛋白.之后研究者对CRISPR/Cas9系统进行深入研究,通过基因工程技术将crRNA(CRISPR-derived RNA)和tracrRNA(trans-activating RNA)进行改造,获得具有靶向作用的sgRNA(single guide RNA),在sgRNA的靶向作用下,Cas9蛋白发挥核酸酶切割活性可对目的基因进行编辑.CRISPR/Cas9技术具有操作容易,敲除效率高等特点,是目前构建基因修饰动物最方便的策略,广泛用于基因敲除小鼠研究.

摘要： 目的：研究不同性别、不同年龄核因子相关因子2(Nrf2)基因敲除小鼠(ICR-Nrf2)主要脏器重量和脏器系数。rn 方法：分别取1、3、6月龄Nrf2敲除及正常ICR小鼠雌雄各15只,用Sanorius电子天平分别测定体重和主要脏器重量,计算脏器系数,并进行多因素分析分析。rn 结果：基因型、年龄和性别因素分别对体重的影响和两两交互作用均有差异(P＜0.05)。基因型和年龄分别对几乎所有脏器的重量和系数都有影响(P＜0.01或0.05),而性别因素的影响则因脏器而不同。rn 结论： Nrf2可能在ICR小鼠的生长和发育过程中起着重要作用。

摘要： 本发明涉及转基因构建物及其在制备附睾头部基因条件性敲除小鼠模型中的应用。具体地，发明人发现长度为1.8kb的Lcn5基因启动子序列能驱动外源基因在小鼠附睾头部（特别是中远端特定）区域表达，并由此构建了由该启动子驱动的外源Cre基因表达载体。这种转基因载体能驱动外源Cre基因在动物附睾头部特异地表达，也可以驱动其他基因如CreERT2重组酶等的表达。应用这种转基因体系制备转基因小鼠，能获得很高的基因组整合率（>25%），并可准确、高效驱动外源基因在附睾头部中远端区域表达。本发明还建立了附睾头部特定区域条件性基因敲除或过表达技术平台。

摘要： 本发明涉及转基因构建物及其在制备附睾头部基因条件性敲除小鼠模型中的应用。具体地，发明人发现长度为1.8kb的Lcn5基因启动子序列能驱动外源基因在小鼠附睾头部（特别是中远端特定）区域表达，并由此构建了由该启动子驱动的外源Cre基因表达载体。这种转基因载体能驱动外源Cre基因在动物附睾头部特异地表达，也可以驱动其他基因如CreERT2重组酶等的表达。应用这种转基因体系制备转基因小鼠，能获得很高的基因组整合率（>25%），并可准确、高效驱动外源基因在附睾头部中远端区域表达。本发明还建立了附睾头部特定区域条件性基因敲除或过表达技术平台。

摘要： 本发明公开了巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型的构建方法及其应用，涉及生物技术领域。巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型的构建方法为基于CRISPR/Cas9系统特异性敲除巨噬细胞TYMP基因，敲除位点为TYMP基因的第2外显子序列上游和第4外显子序列下游。通过该方法构建的巨核细胞条件性敲除TYMP基因小鼠模型能够存活五个月以上，在筛选抑制血小板活化相关药物和研究血栓和炎症相关疾病的分子机制方面具有很好的应用前景。

摘要： 本发明公开Bestrophi n3血管平滑肌特异性基因敲除小鼠和主动脉夹层小鼠模型的构建方法，涉及小鼠模型建立领域。主动脉夹层小鼠模型包括以下构建步骤：采用Bestrophi n3血管平滑肌特异性基因敲除小鼠，简称Best3

摘要： 本发明公开了一种GLCCI1基因基于Cre‑LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒、打靶载体及构建方法。具体地，通过利用Cre/loxP原理，在GLCCI1的一段目标序列两端各放置一个loxP序列，得到flox小鼠，将flox小鼠与全身性敲除Cre品系的小鼠交配繁殖，获得全身性敲除GLCCI1基因的小鼠品系，获得的GLCCI1基因敲除小鼠将可应用于GLCCI1基因及蛋白质功能研究。

摘要： 本发明公开了一种检测SR-BⅠ基因敲除小鼠基因型的方法及试剂盒，方法包括：设计并合成引物和探针；提取小鼠的DNA；实时荧光定量PCR检测。试剂盒包括：核酸提取试剂、PCR反应试剂、ddH

摘要： 本发明公开了一种检测载脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法及试剂盒，方法包括：设计并合成引物和探针；提取小鼠的DNA；实时荧光定量PCR检测。试剂盒包括：核酸提取试剂、PCR反应试剂、RNase-free水以及引物和探针。设计的引物包括野生纯合型上游引物、野生纯合型下游引物、野生纯合型探针、敲除纯合型上游引物、敲除纯合型下游引物以及敲除纯合型探针。本发明的方法可在1h内完成基因型检测，而且成本较低，操作简单。本发明的方法结果准确、易判断，且还具有较高的灵敏度。

摘要： 本发明公开了一种G3bp1条件性基因敲除小鼠模型，该模型由以下步骤构建：构建同源重组DNA载体；通过体外转录获得Cas9 mRNA和针对G3bp1基因2号内含子和3号内含子的gRNA；将同源重组DNA载体、Cas9 mRNA和gRNA注射到小鼠的受精卵中；培育获得条件性基因敲除小鼠。能够克服现有技术中G3bp1全身基因敲除小鼠胚胎致死，无法构建小鼠模型的困难，辅助G3BP1在心血管疾病中的研究。

摘要： 本发明提供了一种TBC1D8B基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用，属于生命科学和生物技术领域。TBC1D8B基因的特异性靶位点sgRNA，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的sgRNA3和核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的sgRNA14。本发明将合成的sgRNA和Cas9 mRNA以及打靶载体导入小鼠受精卵中，培育，筛选及交配，获得TBC1D8B基因敲除的小鼠动物模型。

摘要： 本发明公开了SLC35E1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用，属于生物技术领域。构建方法包括：根据SLC35E1基因序列确定SLC35E1小鼠待敲除基因的两对特异性靶点gRNA1和gRNA2、gRNA3和gRNA4，并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA，显微注射入小鼠受精卵并移植至代孕母鼠输卵管内，待产出小鼠后传代培养，经基因型鉴定得到稳定遗传的SLC35E1基因敲除小鼠动物模型。通过构建的SLC35E1基因敲除小鼠动物模型研究银屑病或分枝杆菌感染性疾病，并验证SLC35E1基因在制备和筛选治疗银屑病或分枝杆菌感染性疾病药物中的应用，为人分枝杆菌感染性疾病的作用机制和治疗提供依据。