淫羊藿苷通过AKT/P53通路抑制S-亚硝基谷胱甘肽诱导的内皮细胞凋亡

摘要

目的观察淫羊藿苷（ICA）对S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）诱导的内皮细胞凋亡的影响,并探讨其机制。方法内皮细胞株EA.hy926由浙江大学提供,将细胞按整群随机抽样法,分成空白对照组、损伤组（GSNO组）、不同浓度（高、中和低浓度）ICA干预组（ICA组）以及蛋白激酶B（AKT）通路的蛋白酶抑制剂LY294002抑制高、中和低浓度ICA组。空白对照组为EA.hy926细胞于96孔板培养,未予任何干预;GSNO组为EA.hy926细胞于96孔板培养48 h后给予1 mmol/L GSNO处理;高、中和低浓度ICA干预组为EA.hy 926细胞于96孔板培养24 h后分别加入10、1和0.1μmol/L的ICA预保护24 h,再给予1 mmol/L GSNO处理;LY294002抑制高、中和低浓度ICA组为EA.hy 926细胞于96孔板培养24 h后分别给予高（10μmol/L）、中（1μmol/L）和低浓度（0.1μmol/L）ICA干预的同时加入1μmol/L LY294002,再作用24 h后给予1 mmol/L GSNO进行干预。噻唑蓝染色（MTT）法测定各组细胞存活率。根据不同试剂盒要求,检测各组细胞乳酸脱氢酶（LDH）活性、丙二醛（MDA）含量、活性氧（ROS）活性和线粒体膜电位。Western blot法检测各组细胞AKT/磷酸化AKT（p-AKT）、人抑癌蛋白53（P53）、细胞色素C（CYC）、内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）/磷酸化eNOS（p-eNOS）以及procaspase-3/caspase-3蛋白表达水平。结果（1）各组EA.hy926细胞存活率:GSNO组细胞存活率明显低于空白对照组（P＜0.01）,而高、中和低浓度ICA组均明显高于GSNO组（P均＜0.01）。（2）各组EA.hy926细胞LDH活性:GSNO组的细胞LDH活性明显高于空白对照组[（142.65±5.56）U/L比（50.01±3.42）U/L,P＜0.05],而高、中和低浓度ICA组则均明显低于GSNO组[分别为（98.02±3.52）、（105.29±6.89）和（117.16±4.27）U/L比（142.65±5.56）U/L,P均＜0.05],且降低LDH活性的效果具有浓度依赖性。（3）各组EA.hy926细胞MDA含量:GSNO组细胞MDA含量明显高于空白对照组[（11.14±0.37）nmol/mg比（5.21±0.18）nmol/mg,P＜0.05],而高、中和低浓度ICA组均明显低于GSNO组[分别为（6.60±0.41）、（6.83±0.21）和（8.29±0.07）nmol/mg比（11.14±0.37）nmol/mg,P均＜0.05]。（4）各组EA.hy926细胞内ROS活性:GSNO组ROS活性明显高于空白对照组[（173.15±11.12）%比100%,P＜0.05],而高、中和低浓度ICA组均明显低于GSNO组[（122.56±8.09）%、（134.52±9.09）%、（149.89±9.16）%比（173.15±11.12）%,P均＜0.05],其中以高浓度ICA组尤为明显。（5）各组EA.hy926细胞线粒体膜电位:GSNO组线粒体膜电位明显高于空白对照组（0.84±0.04比0.12±0.04,P＜0.05）,而高、中和低浓度ICA组均低于GSNO组（分别为0.57±0.08、0.63±0.02、0.66±0.04比0.84±0.04,P均＜0.05）。（6）各组EA.hy926细胞内AKT/p-AKT表达:GSNO组细胞p-AKT蛋白表达水平明显低于空白对照组（P＜0.05）,而高、中和低浓度ICA组则均明显高于GSNO组（P均＜0.05）,且呈现浓度依赖性的趋势。而LY294002抑制高、中和低浓度ICA组p-AKT蛋白表达水平与GSNO组比较差异则无统计学意义。（7）各组EA.hy926细胞胞浆和胞核内P53蛋白表达:GSNO组胞浆和胞核内P53蛋白表达均明显高于空白对照组（P均＜0.05）,而高、中和低浓度ICA组均明显低于GSNO组（P均＜0.05）,LY294002抑制高、中和低浓度ICA组与GSNO组比较差异则无统计学意义。（8）各组EA.hy926细胞线粒体和胞浆内CYC、procaspase-3和easpase-3蛋白表达水平:GSNO组线粒体内CYC蛋白表达水平低于空白对照组（P＜0.05）,而胞浆中却高于空白对照组（P＜0.05）。高、中浓度ICA组线粒体CYC蛋白表达水平均高于GSNO组（P＜O.05）,而胞浆中却低于GSNO组（P＜0.05）,低浓度ICA组线粒体和胞浆中CYC蛋白表达水平与GSNO组比较差异均无统计学意义。各组procaspase-3和caspas