Notch1高表达可使钙化的人心脏瓣膜间质细胞骨形态发生蛋白-2、4表达增加

摘要

目的观察钙化的人心脏瓣膜间质细胞（hVIC）Notch1蛋白表达的变化及其对细胞钙化的影响,并探讨其机制。方法体外培养hVIC,将其分为2组,分别为正常对照组和诱导钙化组,前者常规培养,后者在常规培养的基础上加用β—甘油磷酸（500μl）、抗坏血酸（200μl）和地塞米松（100μl）以诱导细胞钙化,2组细胞均培养7 d。另取上述方法诱导钙化的hVIC为钙化对照组,再设钙化抑制组,即为在钙化对照组的基础上加入Notch1特异性抑制剂DAPT 50μmol/L（4μl/孔）,2组细胞均培养7 d。4组均用脂多糖（LPS）诱导细胞的炎症反应。采用蛋白印迹法检测各组细胞内Notch1、磷酸化核转录因子κB（p—NF—κB）、骨形态发生蛋白（BMP）—2和BMP—4的蛋白表达水平,ELISA法测定各组细胞培养液上清中BMP—2蛋白的含量,Von Kossa染色法观察各组细胞钙化的情况。结果（1）诱导钙化组和正常对照组细胞Notch1、p—NF—κB、BMP—2、BMP-4蛋白表达和细胞培养液上清中BMP—2蛋白的含量以及Von Kossa染色结果:诱导钙化组细胞Notch1、p—NF—κB、BMP—2和BMP-4蛋白表达水平均明显高于正常对照组（P均＜0.05）。诱导钙化组培养液上清中BMP-2蛋白含量为（88.23±3.28）pg/ml明显高于正常对照组的（25.41±3.68）pg/ml（P=0.02）。Von Kossa染色可见诱导钙化组细胞形成大小不等的结节,胞质内的沉积物与细胞结节被染成黑色,提示有钙质沉积,而正常对照组细胞形态结构清晰,细胞周围无沉积物形成。（2）钙化对照组和钙化抑制组细胞Notch1、p—NF—κB、BMP-2、BMP-4蛋白表达和细胞培养液上清中BMP—2蛋白的含量以及Von Kossa染色结果:钙化抑制组细胞Notch1、p—NF—κB、BMP-2和BMP-4蛋白的表达水平均明显低于钙化对照组（P均＜0.05）,钙化抑制组培养液上清中BMP-2蛋白的含量为（26.74±4.62）pg/ml明显低于钙化对照组的（80.41±2.96）pg/ml（P=0.02）。Von Kossa染色可见钙化抑制组细胞钙结节明显少于钙化对照组。结论钙化的hVIC Notch1蛋白高表达,促进了BMP-2和BMP-4蛋白表达增加,从而使hVIC发生成骨样改变,诱导细胞钙化,这一机制可能与NF—κB的活化有关。