比较不同方法介导Gαi2羧基末端肽基因拮抗心肌细胞迷走神经效应的研究

摘要

目的通过质粒电穿孔法、腺病毒转染法（rAd）和9型腺相关病毒转染法（rAVV9）转染Gαi2羧基末端肽(Gαi2ctp)基因至乳鼠心肌细胞,比较不同方法的转染效率、心肌毒性以及对胆碱类药物迷走神经效应的拮抗作用,探寻Gαi2ctp基因功能表达的最佳转导途径。方法构建重组质粒pDC316-Gαi2ctp-mCMV-EGFP（质粒电穿孔组）、重组腺病毒rAd-Gαi2ctp-mCMV-EGFP（rAd组）和重组9型腺相关病毒rAAV9-Gαi2ctp-IRES-EGFP（rAAV9组）以及未携带Gαi2ctp基因的空白对照组（n=10）。3种方法转染携带免疫荧光蛋白（EGFP）的Gαi2ctp目的基因至乳鼠心肌细胞,探寻最佳电转导参数和病毒最佳感染复数（MOI）;比较最佳参数下不同方法转染情况和最大效率;AlamarBlue法测定各时间点还原比率评估心肌毒性;Western-blot法检测Gαi2ctp蛋白表达情况。最后以最适浓度的卡巴胆碱干预各组细胞,通过计数细胞整体搏动频率比较3种方法下Gαi2ctp基因的抗迷走神经效应差异。结果 3种方法最佳参数设置下Gαi2ctp-EGFP蛋白均成功表达且差异无统计学意义,转染效率分别于2、1.5、4d达最高（54.2%±4.8%、100%和59.2%±4.4%）,于第11d转染效率分别为（30.1%±6.6%、12.0%±3.4%和36.0%±6.1%）;rAAV9组在全观察期11 d内细胞活性接近空白对照组（P＞0.05）,质粒电穿孔组和rAd组细胞活性于3d后开始明显下降且后者较显著（P＜0.05）。卡巴胆碱以最佳药效浓度200μg/ml干预培养3d后心肌细胞,发现Gαi2ctp基因组较无基因组具有明显的抗卡巴胆碱迷走神经效应（P＜0.05）,但各方法之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论质粒电穿孔法转染方式迅速、转染效率尚可,但对细胞破坏力大;rAd法转染效率最高可达100%,但表达持续时间较短,心肌毒性较大;rAAV9法转染起效较慢但能够稳定地长时间表达且生物安全性最好。3种方法皆可有效表达Gαi2ctp并发挥拮抗卡巴胆碱迷走神经变时效应。该实验为Gαi2ctp转染治疗心房颤动提供了理论支持和方法学依据。