人鼻咽癌顺铂耐药细胞系（CNE2/DDP）的建立及耐药相关基因的筛选

摘要

背景与目的:化疗是鼻咽癌最主要的辅助治疗手段,然而癌细胞耐药性的产生常常导致药物治疗的失败,因此,筛查鼻咽癌耐药相关基因、寻找逆转药物耐受的分子靶点具有重要的现实意义。本研究首先用鼻咽癌药物敏感细胞CNE2作为亲本细胞诱导建立耐药细胞系,并在此基础上,筛选鼻咽癌耐药相关基因,探讨耐药性产生的分子机制。方法:以顺铂（cisplatin,DDP）为诱导剂,采用大剂量冲击与剂量逐渐递加相结合的方法,诱导建立人鼻咽癌耐药细胞系CNE2/DDP。采用MTT法测定药物的敏感性、流式细胞术测定细胞周期及细胞内荧光药物罗丹明的蓄积,并进行细胞生长曲线测绘、倍增时间测定及细胞形态学观察。随后,采用基于PCR技术改良的消减杂交法筛选并克隆耐药相关基因。反向点杂交鉴定排除假阳性,DNA测序分析差异表达片段,RT-PCR对差异表达的基因片段做进一步验证。结果:所建立的人鼻咽癌耐药细胞系CNE2/DDP对DDP的耐药指数为27.9,对5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）及长春新碱（vincristine,VCR）的耐药指数分别可达227.9和55.5,表明其具有多药耐药的特征。流式细胞测定显示耐药细胞内罗丹明的蓄积明显低于敏感细胞（12.98vs.243.62）。镜下观察耐药细胞体积变小,形态变圆,细胞倍增时间明显延长（26hvs.19h）。消减杂交发现了6个差异表