体外研究小鼠心肌细胞自噬过程中人抗原R对溶酶体酸化的作用

摘要

目的 探讨人抗原R在体外培养的小鼠心肌细胞自噬过程中对溶酶体酸化的作用。方法 取1～2 d龄C57BL/6小鼠（雌雄不限）20只,分离心脏培养原代心肌细胞,进行以下实验。（1）采用随机数字表法（分组方法下同）将细胞分为5组,即正常对照组和无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0 h组。正常对照组用DMEM/F12培养基常规培养（常规培养条件下同）54.0 h,无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0 h组常规培养53.5、53.0、51.0、48.0 h后更换无糖无血清培养基分别处理0.5、1.0、3.0、6.0 h,蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）、自噬相关蛋白5、腺苷三磷酸酶V1区E1亚基（ATP6V1E1）蛋白表达。（2）将细胞分为正常对照组和无糖无血清3.0 h组,相应各组细胞处理同实验（1）,激光扫描共聚焦显微镜下观测细胞溶酶体酸化水平。（3）取2个批次细胞,均同实验（1）分组处理,蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白及另一个批次细胞胞质、胞核蛋白中人抗原R蛋白表达。（4）将细胞分为正常对照组、单纯对照小干扰RNA（siRNA）组、单纯人抗原R-siRNA1（HuR-siRNA1）组、单纯HuR-siRNA2组、无糖无血清3.0 h组、无糖无血清＋对照siRNA组、无糖无血清＋HuR-siRNA1组、无糖无血清＋HuR-siRNA2组。常规培养48 h后,单纯对照siRNA组及无糖无血清＋对照siRNA组加入阴性对照siRNA、单纯HuR-siRNA1组及无糖无血清＋HuR-siRNA1组加入HuR-siRNA1、单纯HuR-siRNA2组及无糖无血清＋HuR-siRNA2组加入HuR-siRNA2转染6 h,8组均继续常规培养48 h后,正常对照组及各单纯siRNA处理组更换DMEM/F12培养基、其余各组更换无糖无血清培养基培养3 h,蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达。（5）取2个批次细胞,均分为无糖无血清＋对照siRNA组、无糖无血清＋HuR-siRNA1组,相应各组细胞处理同实验（4）,免疫荧光法观测一个批次细胞人抗原R分布及表达,激光扫描共聚焦显微镜下观测另一批次细胞溶酶体酸化水平。（6）取3个批次细胞,均分为无糖无血清3.0 h组、无糖无血清＋对照siRNA组、无糖无血清＋HuR-siRNA1组、无糖无血清＋HuR-siRNA2组,相应各组细胞处理同实验（4）,蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白中组织蛋白酶D、一个批次细胞胞质蛋白中人抗原R及另一个批次细胞总蛋白中ATP6V1E1蛋白表达。（7）将细胞分为正常对照组、无糖无血清3.0 h组、无糖无血清＋对照siRNA组、无糖无血清＋HuR-siRNA1组,相应各组细胞处理同实验（4）,实时荧光定量反转录PCR法检测细胞ATP6V1E1 mRNA表达。各实验样本数均为3。对数据进行独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果 （1）与正常对照组比较,无糖无血清1.0、3.0、6.0 h组细胞总蛋白中LC3Ⅱ、ATP6V1E1蛋白表达显著增加（t＝12.16、4.05、4.82,11.64、3.29、8.37,P＆0.05或P＆0.01）,无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0 h组细胞总蛋白中自噬相关蛋白5蛋白表达显著增加（t＝6.88、10.56、5.76、9.91,P＆0.05或P＆0.01）。（2）与正常对照组的1.03±0.08比较,无糖无血清3.0 h组细胞溶酶体酸化水平（2.92±0.30）明显升高（t＝6.01,P＆0.01）。（3）5组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达组间总体比较,差异无统计学意义（F＝1.09,P＆0.05）。与正常对照组比较,无糖无血清1.0、3.0、6.0 h组细胞胞质蛋白中人抗原R蛋白表达显著增加（t＝43.05、11.07、5.39,P＆0.05或P＆0.01）,无糖无血清3.0、6.0 h组细胞胞核蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少（t＝11.18、12.71,P＆0.01）。（4）与单纯对照siRNA组比较,单纯HuR-siRNA1组、单纯HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少（t＝4.82、4.44,P＆0.05）。与无糖无血清＋对照siRNA组比较,无糖无血清＋HuR-siRNA1组、无糖无血清＋HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少（t＝4.39、6.27,P＆0.05）。（5）与无糖无血清＋对照siRNA组比较,无糖无血清＋HuR-siRNA1组细胞胞质中人抗原R分布减少、表达水平显著降低（t＝10.13,P＆0.01）。与无糖