阻断转化生长因子β/Smads通路双位点对人皮肤成纤维细胞生成瘢痕相关蛋白的影响

摘要

目的探讨阻断TGF-β/Smads通路的双位点对人皮肤Fb生成瘢痕相关蛋白的影响。方法将携带可溶性TGF-β受体Ⅱ（sTβRⅡ）、突变型Smad 4——Smad 4△M4基因的2种慢病毒载体按最适感染复数（MOI）50分别转染人皮肤Fb细胞株人包皮Fb 1（HFF-1）细胞,蛋白质印迹法测定2种转染细胞的sTβRⅡ、Smad 4△M4蛋白表达情况,并与未转染细胞进行对比。采用随机数字表法将HFF-1细胞分为6组,每组6皿,每皿1×10~4个。共转染组,将2种病毒按MOI=50、1:1混合共转染细胞后用5 ng/mLTGF-β1刺激72 h;sTβRⅡ组,慢病毒sTβRⅡ取MOI=50转染细胞,余处理同前;Smad 4△M4组,慢病毒Smad 4△M4取MOI=50转染细胞,余处理同前;阴性病毒对照组,空载体病毒转染细胞,余处理同前;阳性对照组,仅用5 ng/mL TGF-β1刺激72 h;空白对照组,常规培养细胞,不作任何其他处理。刺激结束后,采用蛋白质印迹法、实时荧光定量RT-PCR法分别检测各组细胞纤维连接蛋白的蛋白和mRNA表达,分别采用ELISA法和Sircol法检测各组细胞培养上清液中结缔组织生长因子（CTGF）及总胶原蛋白表达量。对数据行单因素方差分析及SNK-q检验。结果（1）慢病毒sTβRⅡ转染的HFF-1细胞sTβRⅡ蛋白表达明显高于未转染的HFF-1细胞,慢病毒Smad 4△M4转染的HFF-1细胞Smad 4△M4蛋白表达亦明显高于未转染的HFF-1细胞。经验证,2种慢病毒转染的细胞均能有效表达相应的目的蛋白。（2）6组细胞纤维连接蛋白的蛋白及mRNA表达量总体均差异明显（F值分别为53.536和24.365,P值均小于0.001）。阳性对照组细胞纤维连接蛋白的蛋白与mRNA表达量分别为1.60±0.18、1.99±0.40,与阴性病毒对照组的1.60±0.15、1.94±0.28相近（q值分别为0.091和0.419,P值均大于0.05）,但高于其余4组（q值为5.245~18.228,P值均小于0.05）;共转染组细胞纤维连接蛋白的蛋白与mRNA表达量分别为0.60±0.05、0.70±0.11,明显低于sTβRⅡ组的0.89±0.13、1.24±0.17和Smad 4△M4组的0.91±0.14、1.28±0.19（q值为3.964~4.294,P值均小于0.05）。（3）6组细胞培养上清液中CTGF及总胶原蛋白表达量总体均差异明显（F值分别为107.680和38.347,P值均小于0.001）。阳性对照组细胞培养上清液中CTGF及总胶原蛋白表达量与阴性病毒对照组相近（q值分别为1.106和0.491,P值均大于0.05）,但明显高于其余4组（q值为6.414~26.420,P值均小于0.05）;共转染组细胞培养上清液中CTGF及总胶原蛋白表达量均明显低于sTβRⅡ组和Smad 4△M4组（q值为3.424~7.143,P值均小于0.05）。结论在皮肤Fb中,阻断TGF-β/Smads通路双位点在抑制TGF-β1导致的瘢痕相关蛋白上调方面优于阻断单个位点。