Sp1对肠三叶因子启动子基础转录活性的影响

摘要

目的寻找维持肠三叶因子（ITF）启动子基础转录活性的反应元件。方法以ITF启动子序列为模板,采用PCR方法获取不同长度及突变的ITF基因5’侧翼序列,插入pGL3-basic质粒,构建截短及突变荧光报告载体,进行以下实验。（1）按照随机数字表法（分组方法下同）将人胚胎肾293（HEK293）细胞分为pGL3-basic组、pGL3-300组、pGL3-280组、pGL3-260组、pGL3-240组、pGL3-220组、pGL3-200组,每组3孔,分别转染对应的质粒500 ng及15 ng海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK,培养48 h,单管型多功能检测仪检测细胞荧光素酶相对活性。（2）另取HEK293细胞,分为pGL3-basic组、pGL3-300组及突变体1、2、3、4组,每组3孔,分别转染pGL3-basic、pGL3-300及突变体1、2、3、4质粒500 ng及15 ng pRL-TK质粒。培养48 h,同（1）检测荧光素酶相对活性。（3）另取HEK293细胞,分为空白对照组及10、50μmol/L光神霉素组,每组3孔,转染500 ng pGL3-300质粒及15 ng pRL-TK质粒后,空白对照组不加,后2组分别加10、50μmol/L光神霉素,培养24 h,同（1）检测荧光素酶相对活性。（4）另取HEK293细胞,分为空白对照组及0.1、0.2、0.3μg pcDNA3.1-Sp1组,每组3孔,转染500 ng pGL3-300质粒及15 ng pRL-TK质粒后,空白对照组不转染,后3组分别转染0.1、0.2、0.3μg pcDNA3.1-Sp1质粒。培养48 h,同（1）检测荧光素酶相对活性。对数据行单因素方差分析、LSD检验。结果（1）pGL3-basic组、pGL3-300组、pGL3-280组、pGL3-260组、pGL3-240组、pGL3-220组、pGL3-200组细胞荧光素酶相对活性分别为1.00、7.99±0.51、2.03±0.55、2.50±0.40、2.50±0.15、1.72±0.19、2.10±0.21,pGL3-280组、pGL3-260组、pGL3-240组、pGL3-220组、pGL3-200组细胞荧光素酶相对活性较pGL3-300组显著下降（P值均小于0.01）。（2）pGL3-basic组、pGL3-300组及突变体1、2、3、4组细胞荧光素酶相对活性分别为1.00、7.99±0.51、2.10±0.56、7.03±1.05、5.09±1.40、8.15±1.48,其中突变体1组细胞荧光素酶相对活性较pGL3-300组显著下降（P＜0.01）,突变体2、3、4组细胞荧光素酶相对活性与pGL3-300组相近（P值均大于0.05）。（3）10、50μmol/L光神霉素组细胞荧光素酶相对活性分别为3.07±0.60、2.93±0.55,均显著低于空白对照组的8.05±0.83（P值均小于0.01）。（4）0.1、0.2、0.3μ.g pcDNA3.1-Spl组细胞荧光素酶相对活性分别为12.74±1.12、14.52±1.25、15.66±1.82,均显著高于空白对照组的8.13±0.71（P值均小于0.05）。结论 ITF启动子的-301-293 bp区域存在一个Sp1反应元件,是维持ITF启动子基础转录活性的核心元件。