信号肽去除的耐热碱性磷酸酯酶FD-TAP在大肠杆菌中的亚克隆和高表达

摘要

通过计算机辅助分析,发现在耐热碱性磷酸酯酶(简称FD-TAP)的N端存在26个氨基酸的信号肽序列.但一般信号肽切点并非是完全专一的,所以利用基因工程手段将FD-TAP的N端分别缺失24、25、26和27个氨基酸,得到了N端分别缺失24、25、26和27个氨基酸的克隆子pTAPND24、pTAPND25、pTAPND26和pTAPND27.考虑到这样的克隆子其翻译起始区所形成的能量较低结构稳定的二级结构可能阻碍基因的表达,所以在保证氨基酸序列不变的前提下另外设计了4个引物,得到了二级结构能量大大提高的4个克隆子pTAPND24C、pTAPND25C、pTAPND26C和pTAPND27C.结果表明pTAPND24、pTAPND25和pTAPND27没有表达;pTAPND26和pTAPND24C的表达量较低,pTAPND25C、pTAPND26C和pTAPND27C的表达量较高.通过测定pTAPND25C、pTAPND26C和pTAPND27C的表达蛋白TAPND25、TAPND26和TAPND27的比活和热稳定性,发现无论比活和热稳定性TAPND27明显比TAPND25和TAPND26高且比野生型FD-TAP略高.