基于T7表达系统的洋葱伯克霍尔德菌G63脂肪酶同源高效表达

摘要

为实现对洋葱伯克霍尔脂肪酶的可控高效表达,将目前被广泛使用的T7重组蛋白高效表达系统移植到洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)G63中进行脂肪酶同源表达.首先采用PCR从大肠杆菌BL21(DE3)中得到T7 RNA聚合酶基因(T7 RNAP)并将其克隆到致死质粒pJQ200SK上,然后在T7 RNAP前后各加入500 bp用于同源重组的片段,再通过三亲本杂交把T7 RNAP整合到B.cepacia基因组上,使T7 RNAP受到脂肪酶基因(lipA)启动子调控.接着把lipA和它的伴侣基因lipB单独或全部克隆到载体pUCPCM和pBBR22b上,构建出pBBR22blipAB、pBBR22blipA、pUCPCMIipAB、pUCPCMIipA、pUCPCMAIip△lipB、pUCPCM△lipA、pUCPCMA△lipB七种表达质粒,通过电转化将上述表达质粒转化到含T7 RNAP的B.cepacia宿主菌中,最终得到一系列脂肪酶基因工程菌.通过摇瓶诱导发酵发现含表达质粒pUCPCMIipAB的工程菌脂肪酶酶活最高,达到607 U/mg,与野生菌相比酶活力提高2.8倍.并且除含pUCPCM△lipB的工程菌外,其它工程菌的脂肪酶酶活均有不同程度提高.野生菌与工程菌pUCPCMIipAB的发酵液经硫酸铵沉淀,Sephadex G-75凝胶过滤纯化后,比酶活分别为29 984 U/mg和30 875 U/mg.以上结果表明,构建的基于T7表达系统的B.cepacia脂肪酶基因工程能有效提高脂肪酶的表达量,同时说明分泌信号PelB和增强转录的核糖体接合位点对脂肪酶的表达有促进作用.