人IL35-IgG4(Fc)融合蛋白在CHO/DG44细胞中的稳定表达

摘要

本研究利用基因重组技术构建人IL35-IgG4(Fc)融合基因真核表达载体,稳定转染CHO/DG44细胞并检测重组蛋白的表达.主要采用聚合酶链式反应(PCR)从脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的人髓性白血病细胞株KG-I cDNA文库中克隆EBI3和IL-12p35 cDNA,重叠PCR法连接2个片段,并克隆到IgG4(Fc)-pOptiVECTM-TOPO(R)载体上,对新构建的IL-35-IgG4(Fc)pOptiVECTM-TOPOR真核表达载体并进行酶切、测序、PCR鉴定;脂质体法转染CHO/DG44细胞;RT-PCR检测转染结果, 采用a-MEM-培养基筛选实验组细胞,对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤(Methotrexate,MTX)的加压筛选,ProteinG-Agarose纯化阳性克隆培养上清,免疫印迹检测目的蛋白表达.结果显示IL-35-IgG4(Fc)pOptiVECTM-TOPOR表达栽体稳定转染CHO/DG44细胞并获得阳性克隆;SDS-PAGE电泳得到一条与预期相对分子质量大小相符的蛋白条带;该蛋白能与羊抗人IgG4抗体特异结合.本实验获得了能够稳定表达具有稳定结构的IL35-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞株.